睾丸间质细胞（Leydig Cells,LCs）是动物睾丸中的一种内分泌细胞,负责动物体内大部分睾酮的合成。睾酮是动物体内的一种类固醇激素,在雄性动物生殖系统发育和精子发生过程中具有十分重要的作用。因此,LCs的功能与结构完整对于雄性动物健康的生殖生理活动和正常的精子发生有着重要的作用,它的改变可能导致雄性生殖障碍。LCs合成与分泌睾酮的过程不但受到体内下丘脑-垂体-性腺轴所产生的激素信号调控,同时也受到许多外界因素的影响,如营养、环境等。HT-2毒素是一种常见于发霉农作物中的A类单端孢霉烯族毒素,在世界范围内,已有多起HT-2毒素污染谷物、水体、饲料的报道。摄入HT-2毒素,会对家畜的健康产生危害,引起动物消化系统、免疫系统、生殖系统等不同程度的损伤,严重时会影响家畜的生产性能,损害养殖户的经济利益。造成氧化应激（Reactive oxygen species,ROS）是HT-2毒素在动物体内发挥毒性的主要机制之一。褪黑素（Melatonin）是动物松果体分泌的一种激素,在体内参与调节动物的昼夜节律及年度节律。作为一种强效的抗氧化剂,褪黑素可以清除体内具有毒性的自由基,减少氧化应激的产生。此外,褪黑素可以促进湖羊LCs的睾酮分泌,给公羊注射褪黑素可以增加其射精量、精子浓度、血浆睾酮浓度等生殖指标。本研究旨在探讨褪黑素对HT-2毒素处理导致湖羊LCs激素分泌、细胞增殖、凋亡、自噬等表型变化的影响以及该过程中潜在的分子机制,为研究HT-2毒素对雄性湖羊生殖性能的影响提供新的依据,为进一步揭示褪黑素对HT-2毒素细胞毒性的影响及分子机制提供理论参考。绵羊作为重要的畜牧物种,具有很高的经济价值,而湖羊作为我国的多羔绵羊品种,研究环境毒素对雄性湖羊的生殖健康影响也显得尤为重要。因此,本研究以湖羊LCs为研究对象,首先使用不同浓度的HT-2毒素处理LCs,探究HT-2毒素对湖羊LCs细胞活力、增殖、睾酮分泌、ROS、凋亡与自噬的影响;然后使用200 nM浓度的HT-2毒素处理细胞,尝试添加褪黑素进行挽救,检测褪黑素对HT-2毒素处理后的湖羊LCs细胞活力、增殖、睾酮分泌、ROS、凋亡与自噬的影响。最后,通过对200 nM HT-2毒素处理组、200 nM HT-2毒素+10 nM褪黑素组以及阴性对照组细胞测序,探究HT-2毒素与褪黑素作用于湖羊LCs的潜在分子机制。主要试验结果如下:试验一、褪黑素对HT-2毒素处理导致湖羊睾丸间质细胞睾酮分泌与细胞增殖变化的影响本试验旨在研究褪黑素对HT-2毒素处理导致湖羊LCs细胞活力、睾酮分泌、细胞增殖变化的影响。本研究通过体外培养湖羊LCs,使用不同浓度HT-2毒素（O pM、100 pM、1 nM、10 nM、100 nM、1 μM、10 μM 和 100μM）处理 12 h,并利用 CCK-8检测细胞活力,筛选HT-2毒素影响湖羊LCs细胞活力的最适浓度范围。根据CCK-8结果,进一步使用浓度为0 nM、50 nM、100 nM、200 nM、400 nM的HT-2毒素处理LCs,检测细胞活力;然后采用ELISA、EDU、qRT-PCR、Western-blot等方法检测HT-2毒素对LCs睾酮分泌、细胞增殖的影响。在此基础上,选取200 nM HT-2毒素为试验浓度,分别添加100pM-1 μM浓度梯度的褪黑素,处理LCs并检测细胞活力,并确定10 nM为褪黑素在本实验中的工作浓度。利用ELISA分别检测对照组（C）、200 nM HT-2毒素处理组（H）和200 nM HT-2+10 nM褪黑素处理组（M）培养液中的睾酮浓度,qRT-PCR和Western blot检测睾酮合成、细胞增殖相关基因的表达,EDU和流式检测细胞增殖与周期变化。结果表明:使用不同浓度HT-2毒素（0 nM、50 nM、100 nM、200 nM、400 nM）处理湖羊LCs后,细胞活力以剂量依赖性降低;培养液睾酮含量显著减少,睾酮合成相关基因表达量降低;细胞增殖受到抑制,细胞周期发生改变,增殖相关基因PCNA蛋白与mRNA表达水平显著降低。添加10nM褪黑素,可以有效地缓解HT-2毒素造成的细胞增殖与睾酮合成的抑制。试验二、褪黑素对HT-2毒素引起的湖羊睾丸间质细胞凋亡与自噬的影响本试验旨在研究褪黑素对HT-2毒素引起湖羊LCs氧化应激、细胞凋亡与自噬的影响。根据第三章的结果,使用浓度为0 nM、50 nM、100 nM、200 nM、400 nM的HT-2毒素处理湖羊LCs,然后采用JC-1、透射电镜（TEM）、流式细胞分析、免疫荧光、qRT-PCR和Western blot等技术检测HT-2毒素对LCs细胞凋亡与自噬的影响。此外,本实验检测了对照组（NC）、200 nM HT-2毒素处理组（H）和200 nM HT-2+10 nM褪黑素处理组（M）中氧化应激、细胞凋亡与自噬的相关指标。结果表明:使用不同浓度 HT-2 毒素（0 nM、50 nM、100 nM、200 nM、400 nM）处理 12h 后,LCs细胞内ROS以剂量依赖性增加;细胞凋亡率随毒素浓度增加而上升,BAX/Bcl-2比例,caspase-3,caspase-9等凋亡相关基因表达量增加;细胞自噬水平上升,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例、Beclin-1表达量增加,p62表达降低。这说明,HT-2毒素造成了湖羊LCs细胞内ROS水平升高,引起了细胞凋亡和自噬的发生。而添加10 nM褪黑素导致细胞内ROS水平和细胞凋亡率显著降低,凋亡相关基因表达量下降,细胞自噬程度降低。试验三、转录组测序分析褪黑素对HT-2毒素处理湖羊睾丸间质细胞mRNA水平的影响及候选基因p32的验证本试验旨在从转录组水平探究褪黑素及HT-2毒素处理对湖羊LCs增殖、激素分泌、凋亡与自噬等表型变化影响的潜在分子机制,并对差异表达的候选基因p32在本实验中的表达模式进行验证。首先提取HT-2处理组（H）、褪黑素添加组（M）、对照组（C）三组细胞总RNA,每组三个重复,构建cDNA文库,进行转录组测序,并对筛选的差异表达候选基因p32进行初步验证。结果显示,通过测序,C vs H、H vs M、C vs M间分别有5,607、663、4,392个差异表达基因,结合功能富集分析,发现在代谢、生殖相关GO条目和KEGG通路中有大量差异基因富集,说明褪黑素与HT-2毒素均通过代谢相关等通路影响湖羊LCs;此外,筛选出差异表达基因p32,通过序列扩增、qRT-PCR和Western blot检测HT-毒素处理组以及褪黑素添加组中p32的表达变化。结果显示,在HT-2毒素处理组中p32表达降低,而添加褪黑素后,其表达显著回升。