【摘 要】
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目的 克隆小峰熊蜂(Bombus hypocrite sapporoensis)蜂毒丝氨酸蛋白酶(Bs-VSP)基因,并从粗毒中分离出该蛋白,阐明其抗血栓活性。方法 从小峰熊蜂毒腺cDNA文库中筛选出Bs-VSP基因,以PCR技术扩增其完整cDNA,进行克隆、测序分析,采用快速蛋白液相色谱(FPLC)系统分离纯化Bs-VSP蛋白,对纯品进行N-端氨基酸测序,分析序列特征,并采用同源建模的方法,预测
【机 构】
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天津医科大学药学院生物制药教研室、基础医学研究中心分子靶向药物研究室 College of Nat
【出 处】
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2014年中国药学大会暨第十四届中国药师周
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目的 克隆小峰熊蜂(Bombus hypocrite sapporoensis)蜂毒丝氨酸蛋白酶(Bs-VSP)基因,并从粗毒中分离出该蛋白,阐明其抗血栓活性。方法 从小峰熊蜂毒腺cDNA文库中筛选出Bs-VSP基因,以PCR技术扩增其完整cDNA,进行克隆、测序分析,采用快速蛋白液相色谱(FPLC)系统分离纯化Bs-VSP蛋白,对纯品进行N-端氨基酸测序,分析序列特征,并采用同源建模的方法,预测Bs-VSP空间结构,通过检测其在体外对纤维蛋白原和纤维蛋白的水解作用,阐明Bs-VSP潜在的抗血栓活性。结果 Bs-VSP cDNA由1077个碱基编码358个氨基酸组成,包含N末端信号肽区、前体区和成熟蛋白区三个部分,具有催化活性的成熟Bs-VSP是前体蛋白经酶切后分泌进入毒囊中储存的,酶切位点位于Arg111和Val112之间；成熟Bs-VSP由247个氨基酸编码组成,高度保守基团组氨酸(His160)、天冬氨酸(Asp208)、丝氨酸(Ser309)构成Bs-VSP的催化活性域；成熟Bs-VSP包含4个α螺旋和12个β折叠结构,3个二硫键维持了整个分子的刚性结构,保守基团His160、Asp208、Ser309在空间上形成口袋样稳定的催化三联体；SDS-PAGE显示Bs-VSP的分子量为34kDa；在体外,Bs-VSP能够依次水解纤维蛋白原的Aα、Bβ、γ侧链,形成水溶性降解产物,降低血液粘度,防止血栓生成,纤维蛋白平板试验显示Bs-VSP能够水解交联的纤维蛋白,溶解栓塞。结论 从小峰熊蜂蜂毒中克隆出Bs-VSP；Bs-VSP通过靶向纤维蛋白原及交联纤维蛋白,降低血液粘度,溶解固有栓塞,是潜在的大分子抗血栓药物。
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