论文部分内容阅读
小麦白粉病(Blumeria graminis f．sp．tritici)是小麦生产上的主要病害之一,对其越夏和秋苗菌源量的准确调查是此病害预测预报的依据,而传统调查方法对这两个阶段潜伏侵染的病菌量难以观测,从而影响对病害菌源量的准确估计。本研究的目的是开发小麦叶片中处于潜伏状态白粉菌的分子检测技术,为此病害的监测提供准确快速的新方法。研究根据小麦白粉菌核糖体内转录间隔区(ITS)序列设计合成常规 PCR 引物 F1/R1、F2/R1、F3/R1。应用小麦其它病原真菌做参照,表明所设计的三对引物均对小麦白粉菌有特异性,能区分小麦白粉菌和其它麦类病害。其中 F1/R1较 F2/R1、F3/R1灵敏性更高,可检测到1pg 白粉菌 DNA。在筛选获得的特异性引物 F1/R1所扩增产物的序列基础上,设计合成了 Nested-PCR 内外引物,并对其进行灵敏性测定。应用所设计的 Nested-PCR 流程,从纯培养的病原菌中可检测到的最低病菌 DNA 含量为0．1fg。研究建立了从小麦病叶中提取白粉菌 DNA 的技术。应用常规 PCR 和 Nested PCR 对室内用不同接种量人工接种白粉菌后在不同潜育侵染阶段取样的小麦叶片做病原菌的 PCR 测定分析。用最低接种量300个孢子/cm~2时,采用常规 PCR 能从接种3d 后的小麦叶片中检测到白粉菌 DNA, 而用 Nested-PCR 能从接种1d 后的小麦叶片中检测到潜伏侵染的白粉菌。在人工接种的条件下 Nested PCR 比常规 PCR 对检测相同程度的潜伏侵染至少提前2-3d。在潜育侵染早期和接种浓度低时,Nested PCR 比常规 PCR 在检测效果上有明显的优势。从北京和山东两地的秋苗上,共选取11采样点对人工接种或自然侵染的叶片取样,用常规 PCR 和 Nested-PCR 对未显症叶片的检测结果表明,常规 PCR 测定的叶片侵染率对叶片离体培养测得的侵染率的直线回归预测式只在0．05水平上显著(r~2=0．49,P=0．0163),有6样点未测到侵染病叶。而 nested PCR 测定的叶片侵染率与叶片离体培养测得的侵染率的直线回归式达极显著水平(r~2=0．66,P=0．0023)。此结果表明,Nested PCR 方法的预测性比常规 PCR 方法要好,而且其预测结果比离体培养叶片侵染率偏高,显示 Nested PCR 的高灵敏特性。此研究对小麦白粉病的早期、快速诊断及对病害的监测和预测预报有实际应用价值。