论文部分内容阅读
草酸盐降解菌及其降解酶的研究具有很多潜在的应用价值。一方面可用于致病真菌Sclerotinia sclerotiorum所引起的重要经济作物菌核病的防治,及抗病性转基因植物的生产:另一方面,草酸盐降解酶被用于诊断和治疗与草酸盐相关的疾病,如肾结石,以及环境的生物治理。本论文分离筛选出具有较强草酸盐降解能力的新菌,并对该菌降解酶的酶学性质及降解机理进行了研究。在酸性介质中草酸能够催化重铬酸钾对次甲基蓝的氧化脱色反应,这种催化效率与草酸浓度呈正相关,据此建立了次甲基蓝-重铬酸钾体系测定草酸的方法。实验证明,在660 nm处不加草酸与加草酸的次甲基蓝-重铬酸钾体系反应后的吸光度差值△A在0~80μg/mL范围内与草酸浓度呈线性关系,线性方程为:△A=0.0984ρ草酸-0.0044,相关系数为0.9986。反应的最适条件为3.752×10-5mol/L次甲基蓝、0.12mol/L H2SO4和2×10-3mol/L K2Cr2O7。以草酸盐为唯一碳源和能源,从土壤中分离筛选获得一株能够降解草酸及其盐类的细菌,命名为OXJ-11。该菌在形态培养基形成的菌落为乳白色,圆形;革兰氏阴性染色为阴性杆菌;经电镜观察,为端生双鞭毛。接触酶阳性:不还原硝酸盐。能够在温度25℃-35℃范围内和pH6.0-10.0范围内好氧生长。根据其形态特征、生理生化特征及16SrRNA序列同源性分型,OXJ-11为Pandoraea属的一株新菌。这种菌能够合成草酸盐降解酶。OXJ-11产酶的最适发酵培养基配方为:0.5%草酸钠,0.3%酵母浸粉,0.05%MgSO4·7H2O,最适温度为30℃,pH为6.0-7.0。Pandoraea sp.OXJ-11的草酸盐降解酶为底物草酸盐诱导酶。以次甲基蓝-重铬酸钾氧化还原法测定反应体系草酸盐的减少量,建立了草酸盐降解酶的酶促反应体系。该酶为胞壁酶,超声破碎的条件为:输出功率200w-300w,超声破碎0.5s、间歇5s,破碎总时间7min。草酸盐降解酶的最适初始底物浓度为0.7mg/mL;最适反应温度为30℃;30℃下保温酶活力较稳定;酶反应的最适pH范围较宽为5.5-8.0;粗酶液在pH7.0-8.0范围内保温比较稳定;不同浓度的Fe2+和Cr3+对酶均有抑制作用;SDS对酶有很强的抑制作用;10mmol/L的Mg2+对酶有一定的激活作用;NaCl对酶活力有较大的影响,0.15mol/L NaCl可使酶活力下降约50%,浓度达到0.3mol/L时酶活力完全丧失。草酸盐降解酶的酶解产物之一为二氧化碳,当反应体系中含有阳离子时,二氧化碳会与阳离子反应生成碳酸盐。而过氧化氢不是酶反应产物。甲酸盐为酶解反应的另一产物,但由于OXJ-11菌中含有甲酸盐脱氢酶,因此,甲酸盐被进一步降解生成二氧化碳。OXJ-11菌的草酸盐降解酶所催化的反应,必须在有氧条件下才能进行。草酸和琥珀酸为草酸盐降解酶的可替换底物。ATP和ADP对草酸钠降解酶活性均有不同程度的抑制作用。