病程相关蛋白PR5,属类甜蛋白家族（Thaumatin-1ike proteins,TLPs）,前期笔者对该基因结构域进行预测,综合结果分析该基因有95.1%的可能性为胞外蛋白,含有信号肽。现笔者将利用Gateway技术构建小麦病程相关蛋白TaLr19TLP1（不含信号肽）和TaLr 19TLP1-SP（含信号肽）的克隆载体。依据Gateway中定向克隆TOPO技术的要求设计引物,将目的基因连接到pENTR^TM/D-TOPO（入门载体）上,并对终载体pEarleyGate 103（PEG103）进行酶切改造,使目的基因在LR酶的作用下,连接到PEG103上,形成重组载体TaLr19TLP1-PEG103和TaLr19TLP1-SP-PEG103,将二者转化到农杆菌GV3101中,通过烟草瞬时表达技术,使用激光共聚焦显微镜进行亚细胞定位的观察。亚细胞定位结果显示,TaLr19TLP1定位于细胞膜,而TaLr19TLP1-SP通过质壁分离实验验证,该基因定位于胞外。Western blot证明,笔者构建的融合蛋白在烟草叶片中可以表达。本实验中使用的Gateway技术不需进行BP反应,只需要一套体系和一支LR酶即可完成,打破了传统的酶切连接转化的方法构建载体,更加方便快捷。