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目的蛇毒是毒蛇从毒腺中分泌出来的复杂混合物,毒理学分类可分为神经毒素、抗凝血毒素、及促凝血毒素等各种毒素蛋白/酶,主要成分为蛋白质。目前针对蛇毒相关蛋白质的分析鉴定方法主要针对分子量及组分丰度/分布、(C-或N-端)氨基酸序列、氨基酸组成、活性等展开。质谱分析因其高灵敏、高准确、高通量特性,在蛇毒结构鉴定方面应用广泛。我们建立了一种胰蛋白酶酶切结合超高效液相色谱-高分辨串联质谱(UPLC-HRMS/MS)的分析检测方法,以胶内酶切和溶液酶切互为比对,并针对2019年6月某地公安局在火车站安检管控中查获的某乘客携带疑似蛇毒毒液的可疑样品进行了分析鉴定。方法以CCK-8法检测样品对人肺成纤维细胞(HLF)的增殖抑制作用以明确其毒性;采用BCA法检测可疑样品是否为蛋白质并测定样品中的蛋白质浓度;以SDS-PAGE分析蛋白质分子量及丰度分布;样品经胰蛋白酶进行溶液酶切或胶内酶切后,在LC-Q-OrbitrapMS/MS的Full MS/dd-MS2模式下进行数据采集;随后,将采集的肽质量指纹图谱(PMF)+二级质谱(MS/MS)数据信息导入Proteome Discover 2.1软件,利用SequestHT搜索引擎,在Swissprot 20181122蛋白质数据库中搜寻匹配相关蛋白质并给出匹配的蛋白质和肽段、肽段覆盖率、Sequest HT评分以及与数据库相匹配的y、b离子等信息。为验证上述搜库结果,采用LC-Q-Orbitrap MS/MS的平行反应监测(PRM)模式靶向筛查肽段覆盖率和SequestHT评分排名均靠前的蛋白质,完成确证鉴定。结果该样品对HLF细胞的IC50值为32.75±1.24μg蛋白/mL;其蛋白质浓度为10.5 g/L;SDS-PAGE电泳结果显示,该蛇毒的分子量范围约为6.4-175 kDa。经胰蛋白酶酶切处理及LC-Q-Orbitrap MS/MS分析后,以SequestHT为搜索引擎,在Swissprot 20181122蛋白质数据库中,以PMF+MS/MS模式搜库,可匹配到15种蛇毒蛋白,UniProt在线数据库查询可知其物种来源主要为中华眼镜蛇(Najaatra)。PRM模式中,除Q98960、P80958、P00760、P84805外的11种蛋白质(P86543、P82885、P07525、P0CH80、P59275、P01442、P60304、P49123、Q9PST3、P62375、P60770),每种蛋白质均满足下述确证鉴定需求:即可提取出至少两条具备丰富y、b离子的特征肽段,且响应较高。结论本研究建立的UPLC-HRMS/MS的分析检测方法,以胶内酶切和溶液酶切互为比对,通过PMF+MS/MS搜索及PRM确证分析,成功鉴定出某疑似样品为中华眼镜蛇蛇毒毒液。该方法的建立可为蛇毒中毒的司法案件鉴定、临床中毒救治提供有效技术支持。