目的:通过观察枸橼酸咖啡因对实验兔体外红细胞的溶血性反应和体内溶血性反应,综合评价受试物的溶血作用,为临床用药提供参考资料。方法:（1）体外溶血试验:选用检疫合格的普通级实验兔1只,雌性。试验分为枸橼酸咖啡因供试品组和市售对照品组,浓度均为20.0mg/mL（临床制剂浓度）。取实验兔耳中央动脉血制备兔红细胞悬液,按不同比例加入临床浓度（20.0mg/mL）的样品,采用肉眼观察和分光光度法判定其溶血性反应。（2）体内溶血试验:选用检疫合格的普通级实验兔18只,雌雄各半,分为阴性对照组、枸橼酸咖啡因供试品组和市售对照品组,每组6只动物。枸橼酸咖啡因供试品组和市售对照品组实验兔按1.0mL/kg经左侧耳缘静脉缓慢推注枸橼酸咖啡因（20.0mg/mL）,1次/天,连续5天,阴性对照组按相同方法给予等体积0.9%氯化钠注射液。分别于首次给药前和首次给药后2h、6h,以及末次给药后2h、6h、24h经耳中动脉采血（10mL/只）,进行白细胞（WBC）、网织红细胞（RET）、红细胞（RBC）计数,并检测总胆红素（TBIL）和直接胆红素（DBIL）水平。末次给药后24h采血后所有动物腹腔注射20%乌来糖（800mg/kg）麻醉,放血安乐死,取肾脏、脾脏、肝脏,福尔马林固定,HE染色,进行组织病理学检查。结果:（1）体外溶血试验:供试品组和市售对照品组均有样品管出现上层液体澄明红色,观察结束时振摇管底沉淀,管底无红细胞残留,经吸光度(OD545nm)检测和溶血率计算,供试品组和市售对照品组溶血率大于5%,提示枸橼酸咖啡因供试品和市售对照品均对实验兔体外红细胞可能存在一定的溶血作用。（2）体内溶血性试验:枸橼酸咖啡因注射液供试品组和市售对照品组末次给药后2h、6h和24h的白细胞、红细胞、网织红细胞、总胆红素以及直接胆红素水平均未出现与供试品和对照品相关的异常变化;肝脏、脾脏和肾脏均未见与供试品和对照品相关的病理变化,表明在本试验条件下,枸橼酸咖啡因供试品和对照品未引起实验兔体内溶血反应。结论:本次研究因观察到受试物和市售对照品对红细胞的体外溶血反应,故进一步通过受试物的体内溶血试验来判断其溶血作用。其中体内溶血试验通过考察白细胞、红细胞和网织红细胞计数,以及总胆红素和直接胆红素水平,以综合评价枸橼酸咖啡因的溶血作用。当体内发生溶血反应时,红细胞破坏,红细胞数量减少,反馈性引起网织红细胞增多,破坏的红细胞中血红蛋白溢出,引起血红蛋白血症,严重者可引发血红蛋白尿以及进一步的肾脏病变（肾衰竭或肾炎）。另外红细胞破坏后,其中的血色素被合成为胆红素,引起高胆红素血症,引发肝、脾肿大。本试验结果显示,实验兔的溶血相关指标未发生明显异常改变,同时也未出现与供试品相关的肝、脾和肾脏病理变化。因此结合体外和体内试验结果判定枸橼酸咖啡因无明显的溶血作用。溶血反应机制复杂,目前尚无全面的临床前溶血试验方法,体外溶血结果可能与受试物浓度、反应温度、反应时间以及受试物本身颜色、吸光度等理化性质等均有关;体内溶血结果与受试物的给药浓度、给药速度等均相关,当受试物体外溶血试验出现阳性结果时,可考虑进一步通过体内溶血试验客观地评价其溶血作用,以综合评估临床应用时的安全性风险。