论文部分内容阅读
超氧化物歧化酶(SOD)能特异性清除氧自由基,对保护细胞免受氧化损伤具有重要的作用.目前市场上大多数SOD产品主要来源于动物血液、内脏等,由于原材料有限、纯化困难等原因,导致SOD的纯度低、产量少;而天然微生物和植物来源的SOD也因其种类少、表达量低、酶分子量大,与动物及人体内SOD的同源性低,使得其难以得到广泛的应用.
在前期研究中，课题组已经克隆得到了源于梅花鹿的Cu/Zn-SOD基因，构建了表达重组SOD的毕赤酵母工程菌GS115。本论文在此基础上，继续开展重组工程菌GS115的发酵工艺条件优化、重组SOD的分离纯化和酶学性质等方面的研究。具体实验结果如下:
1.对毕赤酵母工程菌的生长和产酶条件进行优化，优化后的工艺条件为:毕赤酵母种子培养采用YPD培养基(pH6.0),30℃,200r/min培养15h;发酵培养基为pH6.0的BMMY(含500μmol/L硫酸铜溶液和1000μmol/L硫酸锌溶液);诱导产酶条件为:接种量5％，初始甲醇添加量1%，每隔24h补充1%甲醇，200r/min,30℃培养96h时，重组SOD活力为1876U/mL，相较于优化前BMMY培养基发酵96h的酶活力(483.9U/mL)提高了3.88倍。
2.结合毕赤酵母发酵手册和发酵实验优化结果，确定毕赤酵母工程菌的5L发酵罐生产工艺为:BSM培养基，pH6.0，接种量5%，发酵温度35℃，转速900r/min，保持发酵过程溶氧(DO)于20%左右。发酵142h最高酶活力可以达到102789U/mL，相比优化前提高了4.5倍，相比摇瓶提高了54倍。
3.通过超滤、弱阴离子交换色谱(DEAE)、高效凝胶色谱(TSK gel G63000 SW)分离纯化，重组Cu/Zn-SOD的比活力为17647.1U/mg、回收率为36.84%.
4.对重组Cu/Zn-SOD的酶学性质研究表明，最适反应pH为8.0，最适反应温度为30℃;在pH5-9之间较为稳定，保温1h后仍能保留80%以上酶活力;60℃下保温1h酶活保持在90%以上，在70℃下保温20min残余酶活力仍有70%以上。重组Cu/Zn-SOD在中性条件下对蛋白酶耐受性较好，但易受到胃酸的酸解导致酶活力丧失。