论文部分内容阅读
儿童肾病综合征治疗以糖皮质激素为主,多数患儿可以迅速缓解,但部分患儿出现原发或继发糖皮质激素抵抗,导致临床症状不能缓解,出现进行性肾脏损害,糖皮质激素抵抗发生机制至今不清。糖皮质激素是脂溶性类固醇激素,与细胞浆中的糖皮质激素受体(GR)结合211位丝氨酸磷酸化后转位入核发挥作用。糖皮质激素抵抗的机制目前尚不清楚,临床观察表明感染与激素抵抗密切相关,我们认为有感染或多途径所导致的细胞外信号调节激酶(ERK)的持续活化可能是儿童肾病综合征发生糖皮质激素抵抗的关键。本研究首先观察儿童肾病综合征糖皮质激素抵抗病人外周血淋巴细胞ERK活化及糖皮质激素受体GRα核转位受阻情况,以及ERK抑制剂对体外培养的糖皮质激素抵抗病人外周血淋巴细胞及糖皮质激素受体GRα核转位受阻的解除作用,在此基础上,采用超抗原SEB体外诱导糖皮质激素抵抗发生,深入探讨ERK通路在儿童肾病综合征糖皮质激素耐药中的作用机制。方法1.收集儿童肾病综合征激素耐药13例(最初激素敏感,其后不明原因出现激素耐药)和激素敏感7例外周血单个核细胞(PBMCs),Western-blot观察磷酸化ERK水平,激光共聚焦显微镜观察糖皮质激素受体GRα核转位情况,计算核浆比;2.体外观察MEK/ERK抑制剂U0126逆转激素耐药患儿PBMCs糖皮质激素受体GRα核转位障碍的作用;3.采用超抗原SEB体外诱导糖皮质激素抵抗模型;4.采用Western-blot发生观察体外模型中ERK活化时程:5.观察MEK/ERK抑制剂U0126和P38抑制剂SB203580逆转SEB诱导的糖皮质激素抵抗作用;6.观察MEK/ERK抑制剂U0126和P38抑制剂SB203580对激素抵抗模型细胞糖皮质激素受体GRα核转位的影响。结果1.Western-blot结果表明,与激素敏感相比,激素耐药患儿PBMCs存在显著的ERK磷酸化,以及糖皮质激素受体GRα核转位障碍;2.MEK/ERK抑制剂U0126逆转激素耐药患儿PBMCs糖皮质激素受体GRα核转位障碍的作用,核浆比由1.09增至1.38,但仍略低于激素敏感组1.46水平;3.(10～500)ng/mlSEB均可诱导PBMCs对DEX抑制细胞增值的抵抗性,各剂量间效应无显著差异,加入MEK/ERK抑制剂U0126后可消除SEB诱导的激素抵抗,而P38抑制剂SB203580则没有作用;4.激光共聚焦显微镜发现,SEB刺激组DEX作用后GRα趋向分布于胞浆,MEK/ERK抑制剂U0126能恢复SEB刺激的PBMCs对DEX的敏感性,增加GRα的核转位和核浆比值,而P38抑制剂SB203580无显著作用;5.Western blotting检测发现与PHA相比,SEB可更早更强诱导ERK1/2磷酸化,作用1分钟后即出现p-ERK1/2,且表达持续时间显著长于PHA,在24h仍维持在高水平表达。结论体内体外实验均表明,糖皮质激素抵抗与显著持续的ERK活化有关,ERK抑制剂可以逆转糖皮质激素抵抗发生。