【摘 要】
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丝氨酸蛋白酶(SP)不仅是海参的一种重要消化酶也参与自溶过程中对胶原蛋白的降解.为揭示刺参丝氨酸蛋白酶的结构特点及在不同组织中的分布情况,本研究利用RT-PCR和RACE技
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丝氨酸蛋白酶(SP)不仅是海参的一种重要消化酶也参与自溶过程中对胶原蛋白的降解.为揭示刺参丝氨酸蛋白酶的结构特点及在不同组织中的分布情况,本研究利用RT-PCR和RACE技术克隆得到SP基因.SP的cDNA全长共1367 bp,ORF全长1131 bp,编码377个氨基酸残基,其中,前15个氨基酸为信号肽,Asp138、His176和Ser325构成催化三联体.将SP基因插入大肠杆菌表达载体pET-28a,实现其在BI21 (DE3)菌中以包涵体的形式大量表达.SDS-PAGE结果显示,目的蛋白分子量约为42 kDa,与预期大小一致.将包涵体溶解后,利用Ni2+亲和柱层析对重组蛋白进行纯化,得到高纯度的重组SP,并进一步制备兔抗重组SP特异性多克隆抗体.利用Protein A Sepharose亲和柱层析对抗体进行纯化,通过Western blot法分析其特异性.结果表明,该抗体特异性良好,且能与天然SP发生特异性反应.利用兔抗重组SP特异性多克隆抗体检测SP在刺参不同组织中含量差异,结果显示刺参内脏和性腺中SP含量较高,在内壁膜中少量存在,体壁中没有检测出SP.
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