【摘 要】
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目的:通过应用抑制性消减杂交技术筛选和克隆乙型肝炎病毒DNA聚合酶末端蛋白TP的反式激活相关基因,从基因和蛋白质水平证实其真实性.
方法:以TP表达质粒pcDNA3.1(-)-TP转
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目的:通过应用抑制性消减杂交技术筛选和克隆乙型肝炎病毒DNA聚合酶末端蛋白TP的反式激活相关基因,从基因和蛋白质水平证实其真实性.
方法:以TP表达质粒pcDNA3.1(-)-TP转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照；制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T／A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序.通过序列同源性搜索比对及电子拼接,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,初步确定基因序列.从转染了pcDNA3.1(-)的HepG2细胞提取总RNA,以RT-PCR技术扩增获得该基因的全长序列,并测序加以证实.将该基因克隆至PET32a+,构建原核表达重组质粒,转化大肠杆菌BL21诱导进行融合表达,重组纯化蛋白免疫动物制备多克隆抗体,并以此为检测试剂结合免疫组化和原位杂交技术探讨新基因在人肝脏组织中的存在和表达情况.
结果:发现新基因命名为XTP3,在GenBank中注册,注册号为AF490252.融合蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式获得高效表达,并经Western blot证实,获得了特异性良好的多克隆抗体,并在肝组织中证实其存在的真实性.
结论:XTP3是乙型肝炎病毒DNA聚合酶TP反式激活的差异表达的新基因,其存在于人类基因组中,是一种编码蛋白,并能在人肝组织中表达,对新基因从基础到临床两方面进行证实而后再考虑功能的研究,减少了盲目性,为新基因的研究证实提供更加系统完整的理论和技术支持.
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