多酶级联反应可以通过多步酶促反应将低成本的简单化合物合成高附加值的复杂化合物,在现代化生物合成转化工艺中日益受到重视。本文研究了一种在大肠杆菌中通过双酶组装策略提高衣康酸产量的方法,将相互作用蛋白结构域PDZ和它的配体PDZlig分别与乌头酸酶ACO和乌头酸脱羧酶CAD进行基因融合,通过融合蛋白胞内共表达的方式,实现两酶的自组装(Fig.1),48h摇瓶发酵后,衣康酸产量从117.25mg/L(双酶未组装菌uCA)提高到222.15mg/L(双酶组装菌sPP)。为进一步验证组装的效果,进行活细胞催化实验,收集诱导后细胞在恒温恒pH反应器(37C,pH6.5)中催化0.5M柠檬酸钠底物30h,催化反应前期,组装菌sPP催化速率远远高于未组装菌uCA,提高了2倍产量,反应结束后,组装菌sPP衣康酸产量为8.7g/L,相较于未组装菌uCA,提高了74%(Fig.2)。利用动态光散射,蛋白电泳,高效液相色谱等对双酶及胞外双酶组装体系进行了表征和优化。ACO为单聚体蛋白,CAD为二聚体蛋白,组装的最佳比例为亚基摩尔比1:1,且组装速率具有显著的浓度和时间依赖性(Fig.3)。本文研究的双蛋白自组装技术,成功实现异源双酶在胞内胞外的自组装,在大肠杆菌中合成衣康酸,为进一步提高衣康酸产量提供了一条简便可行的途径。