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人工microRNA (artificial microRNA,amiRNA)是一种利用植物内源miRNA的前体作为骨架,替换成熟miRNA序列以获得新的具有靶向能力的一段人工合成的碱基序列。通过设计多组含有靶向病毒不同保守结构域的amiRNA的前体,可以有效降低因病毒进化导致的amiRNA介导的病毒抗性丧失等问题,从而达到防治病毒病的目的。利用该技术,已开发出抗芜菁黄花叶病毒(Turnip yellow mosaic virus,TYMV)、芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)和马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)的拟南芥转基因植株;抗黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)的烟草、番茄转基因植株;抗小麦矮缩病毒(Wheat dwarf virus,WDV)的大麦转基因植株以及抗木薯褐色线条病毒(Cassava brown streak virus,CBSV)的木薯转基因植株等。本研究以拟南芥miRNA前体ath-miR156a、ath-miR164a和ath-miR171a为骨架,设计了6条分别靶向黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)外壳蛋白、运动蛋白和复制酶基因保守区域的amiRNA前体,将其合成后前体序列构入植物双元表达载体pEarleyGate100 (pEG100)中,同时将amiRNA的靶基因构入在GFP CDS区3’端,并构入同样的双元表达载体,两个双元表达载体按1:1的浓度比例混合,利用农杆菌介导的遗传转化法浸润5～6周大小的本生烟植株,以只包含GFP的双元表达载体作为对照,在手持紫外灯(365mm)的照射下,通过荧光强弱来筛选抗病毒效率较高的amiRNA (荧光强度越强,amiRNA对病毒基因的沉默效果越弱;荧光强度越弱则表明amiRNA的沉默效果越强)。研究结果显示:靶向沉默CGMMV复制酶基因的3个amiRNA中,amiRNA2、amiRNA3的效果优于amiRNA1;靶向沉默CGMMV运动蛋白的2个amiRNA中,amiRNA4的效果优于amiRNA5;靶向沉默CGMMV外壳蛋白的amiRNA沉默效果明显;通过CGMMV挑战接种试验检测浸润不同amiRNA的烟草叶片中的CGMMV基因表达量,显示不同amiRNA对CGMMV的抑制效果与其GFP报告系统的试验结果一致。本研究为快速、精准地筛选抗病毒的高效人工miRNA提供了参考方法,为作物抗病毒研究提供了新思路。