小窝(Caveolae)是细胞质膜内陷所形成的囊状结构。小窝蛋白是小窝的主要结构成分，属于结合膜蛋白类。小窝蛋白家族成员包括小窝蛋白-1、小窝蛋白-2和小窝蛋白-3。其中，小窝蛋白-1是参与细胞吞噬、胆固醇平衡和信号传导等过程的主要结构成分，对细胞的生长、发育和增殖有调节作用，与炎症、动脉硬化、致癌转化、心肌肥厚、衰老等多种病理密切相关。胆固醇在形成和维持小窝过程中不可或缺。早期研究表明小窝中富含甾醇类物质，小窝蛋白-1以1:1的比例与胆固醇紧密结合，当小窝中的胆固醇减少过多时，其结构会变扁平，影响某些受体的信号转导过程。小窝蛋白-1通过中央疏水片段和三个棕榈酰化的半胱氨酸残基（Cys133，Cys143和Cys156）插入到膜中，形成一个独特的发卡式α-螺旋结构，而不是穿膜的α-螺旋，蛋白的N-端和C-端位于同侧细胞质中。小窝蛋白-1在膜双分子层中的这种不对称的嵌入方式使得蛋白对磷脂双分子层内叶的扰动要大于对外叶的扰动，对膜的曲率有调节作用，可以促进“小窝”的形成。小窝蛋白-1膜内区域110位的脯氨酸对这种构象的形成起着极其重要的作用，当把Pro110突变以后，螺旋弯曲就会消失。小窝蛋白-1的脚手架区不仅影响该蛋白与膜的结合，也对蛋白的聚集、与其它蛋白的相互作用和对胆固醇的识别有重要作用。位于小窝蛋白-1脚手架区的V94-T-K-Y-W-F-Y-R101片段符合公认的胆固醇识别氨基酸序列（CRAC），被认为是小窝蛋白-1与胆固醇相互作用的关键区域。小窝蛋白-1可以形成包含15个单体分子的高分子量寡聚体，这种聚集与脚手架区的存在密切相关。为了深入了解小窝蛋白-1的结构和CRAC片段在小窝蛋白-1与胆固醇相互作用中的作用，我们用差示扫描量热法（DSC）、荧光光谱、圆二色谱（CD）和衰减全反射傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）对小窝蛋白-1的脚手架区和膜内区域的结构及这些区域与胆固醇的相互作用进行了研究。我们表征了这些功能区域的二级结构，探测了这些区域对胆固醇在膜内分布的影响，并研究了CRAC片段在诱导胆固醇聚集中的作用。我们还用核磁共振（NMR）、CD和电泳（SDS-PAGE）方法测定了小窝蛋白-1嵌膜区的三维空间结构及聚集。我们选择了三段包含CRAC区域的肽段（分别是94-101、82-101和93-126）、一段不含CRAC序列的肽段（101-126）及三个包含CRAC区域的肽段的Y97I突变体作为研究对象，在肽的结构和聚集的研究中选取十二烷基硫酸钠（SDS）和十二烷基磷酸酰胆碱（DPC）及1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇（HFIP）作为膜模拟环境，在肽和胆固醇的相互作用研究中选取了二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）模拟脂质体环境。DSC结果表明，研究中所用的全部肽段均导致胆固醇在DPPC膜中的重新分布，但它们对胆固醇在DPPC膜中重新分布的调节与肽的性质相关。在三种含有CRAC区的肽段中，93-126肽表现出非常强的促进胆固醇聚集的能力，82-101肽段促进该区域形成的能力比93-126的弱，但是比94-101的强。与93-126相比较，101-126肽段不能使胆固醇在DPPC膜中进一步聚集，反而使之更加分散。Y97I突变使得包含CRAC区的所有肽段分离胆固醇的能力减弱。荧光实验结果表明，胆固醇诱导磷脂膜中的肽向膜的表面移动。对于包含CRAC区的肽段来说，野生型肽中的色氨酸在环境上的改变比突变体肽更为显著，表明野生型肽比突变体肽更易与胆固醇发生相互作用。相反，缺少CRAC片段的101-126肽的荧光受磷脂膜中胆固醇的影响很小。CD和ATR-FTIR的研究结果表明，94-101、82-101和93-126在DPPC膜上形成的主导结构分别是无规卷曲、折叠和螺旋结构，这些结构上的差别可能与它们对DPPC膜中胆固醇分布的影响相关。CRAC区与DPPC膜中胆固醇的相互作用可能对插膜的螺旋和脚手架的折叠起稳定的作用。Y97I突变造成CRAC区部分螺旋结构的解折叠。所有这些实验结果均说明，CRAC区是小窝蛋白-1与胆固醇相互作用的重要区域，CRAC区中第97位的酪氨酸可能在小窝蛋白-1与胆固醇相互作用过程中扮演了重要的角色。由核磁共振结合动力学计算得到了含小窝蛋白-1膜内区域的两段肽段（101-126和93-126）的三维空间结构，两段肽均显示了‘螺旋-柔韧区-螺旋’的结构特征，即在Leu103-Phe107和Ile117-His126两个区域形成螺旋，中间的Gly108-Gly116区域为柔性链段。研究发现108位和116位的甘氨酸对螺旋结构的断开起重要作用。来自CD、SDS-PAGE和NMR的结果都表明含CRAC片段的肽段93-126比不含CRAC片段的肽段101-126表现出更强的聚集能力，说明CRAC区可能对小窝蛋白的聚集起促进作用。