漆酶,一种多酚氧化酶,富含铜,具有非常广泛的底物,酚类、非酚类化合物、木质素以及持久性的环境污染物等都能够被它降解,且产生的唯一产物是水,是一种环保型酵素。漆酶在生物技术和工业中得到了广泛应用,可应用于环境保护、生物修复等领域,具有较高的经济应用价值。漆酶存在于植物、动物、细菌、真菌等中,其中,真菌是其主要来源,白腐真菌下的担子菌更是其主要生产者。云芝（Trametes versicolor）,是一种白腐真菌,属于担子菌,是多孔栓菌属,是漆酶主要来源菌种,该真菌极具药用价值和食用价值,具有良好的发展前景。漆酶是云芝生长发育过程中一种重要的木质素降解酶,其活性和产量高低对于云芝木质素降解能力和云芝漆酶的品质形成具有重要影响作用。因此漆酶作为一种具有广泛应用价值的酶越来越受到学者们的重视。而影响漆酶产量的因素包括很多,比如环境条件（pH、温度、碳源、氮源等营养物质）、不同种属微生物间的相互作用、化学物质（金属离子、木质素及其衍生物、芳香族化合物等）等。对于各种影响漆酶产量的因素中,金属离子得到了广泛的研究,特别是铜离子的加入会使漆酶产量发生显著的变化。因此,揭示铜离子诱导下云芝漆酶基因表达的调控机制,对于进一步提高云芝漆酶产量,促进其广泛的工业应用具有重要的意义。但是对于T.versicolor而言,目前还未有高效稳定的遗传操作工具,限制了包括漆酶在内的云芝功能基因的分子生物学研究。本文以云芝（T.versicolor）作为研究对象,成功构建了根癌农杆菌介导的转化方法了,实现了报告基因的过表达,为云芝的分子生物学研究提供了技术支持。然后,通过检测铜离子和芳香族化合物香草酸诱导下云芝漆酶的活性与转录水平,发现显著受到铜离子诱导调控的2个漆酶基因（TvLac3和TvLac4）。据此,构建了LAC3和LAC4启动子控制的报告基因表达系统,并证明了该质粒系统背景信号低,诱导表达信号强,可以用于启动子截断体实验以鉴定响应铜离子诱导的顺式作用元件。最后,通过铜离子诱导/非诱导条件的比较转录组数据分析了,发现了表达水平受铜离子诱导变化显著的转录因子,它们可能参与了云芝漆酶的转录调控。本研究为深入理解云芝漆酶诱导表达机制提供了重要的技术支持与候选因子。主要工作和结果如下:1、成功构建了基于根癌农杆菌的云芝遗传转化体系。转化条件:根癌农杆菌OD600=0.4-0.5,浓度为200μM的乙酰丁香酮,basta的液体培养基筛选浓度为0.02%,固体筛选浓度为0.2%;carboxin的液体筛选浓度为2μg/mL,固体培养基筛选浓度为20μg/mL,筛选培养基中加入0.03%Silwet L-77,有助于提高杀菌剂的抑制作用,共培养温度为25℃,时间为3-4天。对云芝成功进行了基于跟癌农杆菌LBA4404菌株的转化,并且一个报告基因（红色荧光蛋白DsRed-Max）和两个抗性基因（basta和carboxin）在其自身自带的组成型启动子TvGPD的驱动下被验证成功表达了,表明在该遗传转化体系下,肉眼观察下,不含内含子与含有内含子的启动子结构下荧光表达无明显差异,说明内含子在T.versicolor转化菌株的基因表达中不是不可或缺的;通过PCR技术扩增转化菌株云芝基因组中红色荧光蛋白（DsRed-Max）和两个抗性基因（basta和carboxin）区域筛选验证阳性转化子,证实了目的基因被成功整合到T.versicolor的基因组上;为观察其遗传稳定性,在无抗性的基础培养基平板上连续传代后进行了验证,在三代之内报告基因和抗性基因等外源基因能够稳定存在于云芝基因组上,但是表达有一定的沉默。这一遗传转化体系,可以为T.versicolor的其它基因功能与调控研究等分子生物学研究提供技术支撑。2、通过测定两种不同诱导物质（铜离子、香草酸）对云芝漆酶酶活的影响,我们确定了1 mM铜离子为本文的诱导物质,以此进行研究,因为相比较于80mg/L的香草酸来说,铜离子对云芝漆酶酶活具有显著的诱导效果,与对照相比,酶活高达上千倍,是一种较好的诱导物质,值得深入研究。且对铜离子诱导下,云芝中7个漆酶基因进行了实时定量荧光PCR验证,表明铜离子对云芝漆酶的影响体现在转录水平上,1 mM铜离子可以高效诱导云芝漆酶基因的表达。TvLac3和TvLac4的诱导表达水平较其它几个漆酶基因更显著,在诱导3 h时,上调表达倍数为9倍左右。3、经过在线软件对TvLac3和TvLac4的启动子区域进行了顺式作用元件分析,发现TvLac3和TvLac4启动子区域分半含有35和27种不同类型的顺式作用元件,除了启动子和增强子区常见的顺式作用元件外,还有与温度、厌氧诱导、SA、胁迫、激素以及光响应相关的顺式作用元件。TvLac3启动子区域发现了WRKY类转录因子（响应生物逆境胁迫）的结合位点W-box（TTGACCC）,这启示我们,真菌抗逆防御相关的转录因子可能在转录水平调控Lac3基因的表达。TvLac3和TvLac4启动子区域缺少金属离子响应元件（MRE-metal responstive element）和响应铜离子的ACE1结合位点（ACE1 binding site）,这表明该区域可能存在非常规的响应铜离子的顺式作用元件。4、通过转录组数据分析,结果显示,共获得了893个差异表达基因,其中,上调表达基因有426个,下调表达基因有427个。发现在铜离子诱导显著影响了云芝细胞的新陈代谢和细胞内的氧化应激反应。筛选到了铜离子诱导条件下转录水平显著变化的数个转录因子。