目的：　　 通过分子克隆技术，构建含有大肠杆菌基因的原核表达载体，利用亲和层析分离纯化有活性的蛋白，根据蛋白质对紫外的特征性吸收的特性，利用紫外可见分光光度计从中筛选铁硫蛋白，为进一步探索铁硫蛋白功能奠定基础。　　 方法：　　 1．含有大肠杆菌基因的原核表达载体的构建首先在www.ecogene.org网站上寻找大肠杆菌中功能未知的基因，从中挑选我们感兴趣的基因（原则：目的片段较小，至少含有三个半胱氨酸或者组氨酸），使用DNAMAN和Primer5.0设计特异性引物，利用PCR方法，以大肠杆菌K-12为模板，扩增31个大肠杆菌基因yacC、yfhB、yieE、yjfM、yabI、yabP、yjiL、yjiK,yjjQ、yhdZ、yadL、yacF,yafW,yagN、ygfS、yggI,yhfA、yhfY、yhhY、yieH、yjbM、yjcZ、yjdM、yjeJ、yjeN、yjhI、yieP、yjeS、yjgM、ygH和yjhP，将其连接到原核表达载体pET28b(+)，然后转化到E.coliBL21(DE3)进行抗性筛选，以阳性克隆菌株为模板，进行菌落PCR鉴定或者将克隆质粒进行双酶切鉴定，经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定其片段大小与目的片段相似，然后送至大连宝生物公司测序，鉴定重组质粒构建正确。　　 2．蛋白的表达、分离与纯化将构建正确的重组质粒转化到E.coliBL21(DE3)表达菌株中，用IPTG诱导表达上述基因所编码的带有His标签的蛋白，利用镍柱亲和层析技术纯化和G-25脱盐柱脱盐后，SDS-PAGE分析表达产物。　　 3．铁硫蛋白的筛选Fe含量的测定：将纯化后的蛋白与2mM的L-半胱氨酸和500μM的菲咯嗪混合物在85℃加热20分钟后，室温放置半小时，12000rpm离心5分钟，用Du800自500nm到700nm全波长扫描，利用铁-菲咯嗪复合物在564nm处有特异性的吸收峰，其在564nm处的消光系数是27.9mM-1cm-1，计算蛋白中铁浓度公式为：CFe=(OD564-OD700)/27.9*1000(单位μM)。S含量的测定：大肠杆菌核酸内切酶Ⅲ(Nth)是个[4Fe-4S]簇蛋白，其铁和硫含量稳定，可根据上述公式计算其硫的消光系数以用于计算未知蛋白中硫含量；将纯化后的蛋白和2mM的N，N-二乙基对苯二胺硫酸盐(DPD，溶解在7.2M的HCl)、3mM氯化铁(溶解在2MHCl)混合物室温放置20分钟，12000rpm离心5分钟，用Du800自500nm到700nm全波长扫描，硫化物与N，N-二乙基对苯而胺及氯化铁作用，生成稳定的蓝色，在669nm有特异性吸收峰，计算单位蛋白的铁硫含量，公式为：Cs=(OD564-OD700)/S的消光系数(单位μM)。　　 4．跨膜螺旋(TMH)的预测利用TMMTOP、MEMSAT、TMHMM、TopPre和Predictionprotein生物网站软件预测不可溶蛋白中可能存在的跨膜螺旋结构。　　 结果:　　 1．测序结果表明31个克隆质粒与NCBI比对结果一致，证明克隆质粒构建正确。经诱导剂在一定条件下诱导表达后，YjiL、YjeS、YjgM、YjdM、YacF、YhfA、YhfY、YhhY、YieH、YjcZ、YjhI、YjeJ、YjeN、YjhP、YgjH、YieP和YieE是可溶的，其中YjiL、YjeS和YjgM可能是铁硫蛋白，YjdM和YchJ可能是载铁蛋白；YagN、YggI、YgfS、YafW、YjbM、YacC、YfhB、YjfM、YabI、YabP、YjiK、YjjQ、YhdZ和YadL为不可溶表达。　　 2．通过生物信息学研究，我们发现下面蛋白可能含有跨膜螺旋：YagN1个TMH、YggI1个TMH、YgfS1个TMH、YafW1个TMH、YjbM1个TMH、YacC1个TMH、YfhB1个TMH、YjfM1个TMH、YabI6个TMH、YabP0-1个TMH、YjiK1个TMH、YjjQ1个TMH、YhdZ0-1个TMH和YadL1-2个TMH。　　 结论：　　 我们熟练掌握分子克隆和亲和层析技术，成功构建了31个表达大肠杆菌基因的重组质粒，并将其纯化，从中筛选鉴定铁硫蛋白，在17个可溶表达的蛋白中我们发现了3个功能未知的铁硫蛋白，另外14个可能含有跨膜螺旋的不可溶蛋白，为进一步探索大肠杆菌铁硫蛋白功能奠定基础，为铁硫簇生源论提供有利依据。