三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）是我国沿海重要的经济蟹类，属于广盐性水生物种，整个生活史都受到外界水环境盐度的影响。从分子水平上了解三疣梭子蟹的渗透调节机制对三疣梭子蟹种质资源的改良和水产养殖具有重要意义。热休克蛋白(Heat shock protein，HSPs)，是一组在生物进化过程中高度保守的蛋白分子。当机体受到逆境胁迫时，细胞内蛋白发生变性，而热休克蛋白可以识别变性蛋白的疏水区域，协助变性蛋白重新恢复天然构象，提高细胞的胁迫耐受性。热休克蛋白是包括多种分子的蛋白家族。其中，HSP60和HSP90是两类常见的热休克蛋白分子。HSP60具有变性蛋白优先结合能力，保护细胞免受逆境胁迫伤害；HSP90不仅能保护细胞不受胁迫伤害，还能与细胞功能蛋白特异结合，改变蛋白功能状态。利用简并引物，我们首次克隆得到三疣梭子蟹HSP60基因，其开放阅读框序列全长为1734bp，编码577个氨基酸，预测分子量为61.25kDa，等电点为5.23。该氨基酸序列包含HSP60家族信号位点以及特征基序。同源性分析与系统发育树表明三疣梭子蟹HSP60与已知的HSP60蛋白序列高度同源，与南美白对虾Litopenaeus vannamei HSP60亲缘关系最近，蛋白序列同源性为96%。利用半定量RT-PCR检测HSP60基因在肝、心、卵巢、腹肌、触角腺、真皮、肠、附肢肌肉、鳃9种不同组织中的表达。结果表明：HSP60mRNA在三疣梭子蟹各组织中均有表达。正常盐度条件下，HSP60在触角腺和肠中表达量略高于其它组织。低盐（10‰）胁迫12hr后，卵巢HSP60mRNA表达量明显增加（p<0.01），约为胁迫前水平5.52倍，其次是鳃、心和附肢肌肉，分别为2.14、2.0、1.96倍，而触角腺、肠表达量显著减少（p<0.05），约为0.44、0.36倍；高盐（40‰）胁迫12hr后，卵巢HSP60mRNA表达量显著增加（p<0.001），约为胁迫前水平5.57倍，其次为真皮、鳃，约为3.66、2.4倍。盐度胁迫基本不影响肝、腹肌中的HSP60mRNA表达。利用半定量RT-PCR技术检测盐度胁迫下，三疣梭子蟹鳃中HSP60基因随胁迫时间的表达情况。结果显示：10‰低盐胁迫24hr内，三疣梭子蟹HSP60mRNA表达量逐渐增加（p<0.05），约为胁迫前水平2.5倍；40‰高盐胁迫12hr，HSP60mRNA表达量迅速增加到最大值，约为4.26倍，随后表达量减少。利用western blot技术检测了盐度胁迫下，三疣梭子蟹鳃中HSP60蛋白随胁迫时间的表达情况。结果显示：10‰、40‰盐度胁迫后，三疣梭子蟹HSP60蛋白表达量在前24hr基本稳定，48hr表达量增加，之后表达量保持不变。利用半定量RT-PCR技术检测盐度胁迫下，三疣梭子蟹鳃中HSP90基因随胁迫时间的表达情况。10‰盐度实验组的三疣梭子蟹鳃hsp90α mRNA表达量逐渐减少（p<0.05），120hr最低值约为胁迫前水平0.12倍，而40‰盐度实验组的hsp90α mRNA表达水平先上调后下降。40‰高盐胁迫12hr时HSP90α mRNA表达量稍有减少，随后在24hr时上调到最大值，约为胁迫前水平1.21倍，之后逐步下降，在120hr时达到最低值，约为0.22倍。为证明三疣梭子蟹HSP90α蛋白与盐度胁迫的相关性，我们根据GenBank上提供的三疣梭子蟹HSP90α基因蛋白编码区序列，构建pET28-HSP90α原核表达重组质粒在大肠杆菌DE3(BL21)中进行盐度胁迫表达。结果显示：重组质粒的大肠杆菌生存率明显高于转空载体的大肠杆菌，在越接近大肠杆菌盐度耐受极限值时，两者差异越显著，在盐度胁迫最高值(1050mmol/L)下，两者差异达到10.7倍。这说明在盐度胁迫下三疣梭子蟹HSP90α对大肠杆菌有保护作用,能显著提高大肠杆菌对盐度胁迫的耐受力。总结来看，盐度胁迫下，三疣梭子蟹HSP60mRNA和蛋白表达量均增加；以及鳃中HSP90α mRNA表达水平的提高与原核体外表达实验结果都暗示三疣梭子蟹HSP60和HSP90α可能参与了三疣梭子蟹盐度适应过程。本项研究丰富了热休克蛋白的分子功能，并为三疣梭子蟹淡水养殖的发展提供了一定的理论基础。