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慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染影响全世界约2.57亿人，并且是引起乙型肝炎肝硬化、肝细胞癌等肝脏疾病的主要原因。临床上常使用核苷(酸)类似物(NAs))来抑制病毒复制，但是耐药性病毒株的选择常常会导致治疗失败和疾病的进展。而且，耐药性的发展始于HBV聚合酶基因的突变，随后数周至数月后病毒载量和血清丙氨酸氨基转移酶水平升高。因此，抗HBV耐药性突变的检测对于迅速制定新的治疗方案至关重要。
第一部分乙型肝炎病毒逆转录酶区耐药突变检测方法的建立与评价
目的
本研究探讨建立一种检测HBV逆转录酶区10个经典耐药位点的PCR产物直接测序方法。
方法
1建立检测HBV逆转录酶区耐药突变的PCR产物直接测序方法
根据HBV逆转录酶区常见的突变位点，采用PrimerPremier6.0软件设计了覆盖HBV基因型B和基因型C的逆转录酶区rt169至rt250位点的通用引物。以慢性乙型肝炎患者血清HBVDNA作为模板进行PCR扩增，然后通过琼脂糖凝胶电泳和Sanger测序分析PCR产物，以验证目的基因是否被扩增成功。
2包含HBV逆转录酶区rt169至rt250位点的标准质粒的构建
通过掺入EcoRI和HindIII限制性酶切位点的引物扩增HBVDNA模板，然后分别用限制性内切酶EcoRI和HindIII消化纯化的PCR产物和pUC19克隆载体。在使用T4DNA连接酶将这两个酶切后的DNA片段的磷酸二酯键连接在一起之后，下一步是将重组质粒DNA转化至大肠杆菌DH5α菌株的感受态细胞中。然后进行菌落PCR筛选和质粒DNA测序分析，以确定重组质粒标准模板是否构建成功。
3PCR产物直接测序法的评价
将得到的重组菌株扩大培养，并对提取的质粒DNA进行定量和倍比稀释。以各浓度梯度的标准质粒作为DNA模板，重复PCR扩增3次。然后通过1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，以目的条带检出率为100%时的最高和最低模板浓度分别作为该方法的检测上限和下限。通过建立的PCR方法对经Sanger测序验证的rtM204I突变标本连续重复检测10天，分析该耐药位点的突变检出率，以评价该方法的重复性。依据分子克隆方法构建rtM204I突变型重组质粒，将突变型质粒DNA按一定比例混合到野生型质粒中；对混合DNA模板进行PCR扩增，然后应用MutationSurveyor软件对测序结果进行比对分析，以评价该方法对耐药突变株的检测灵敏度。分别对感染了人巨细胞病毒、人乳头瘤病毒、梅毒螺旋体患者和正常受试者的血清DNA样品以及用作空白对照和阳性对照的蒸馏水和质粒标准品进行PCR扩增和目的条带的检测，以评价该方法的特异性。
结果
(1)通过优化PCR扩增体系和条件，建立了一个标准化的PCR方案以检测HBV逆转录酶区的耐药突变位点。50μLPCR扩增体系为：蒸馏水33μL，20mmol/L10×扩增缓冲液(Mg2+plus)5μL，4种dNTP混合物(每种浓度为2.5mmol/L)4μL，ExTaq聚合酶(5U/μL)1μL，上游引物(10μmol/L)1μL，下游引物(10μmol/L)1μL，模板DNA5μL(<500ng)。PCR扩增条件为95℃预变性5min；94℃变性10s，55℃退火20s，72℃延伸1min；循环40次；最后72℃延伸5min。
(2)通过分子克隆技术成功构建了包含有HBV逆转录酶区rt169至rt250位点的野生型标准质粒。
(3)该方法对血清HBVDNA的检测范围为0.36copies/μL至2.88×1011copies/μL，联合应用MutationSurveyor软件可检测出含量低至5%的耐药突变株。同一样本重复10次PCR扩增和测序分析，rtM204I的突变检出率为100%。在空白对照和HBVDNA阴性标本中均未检出目的条带。
结论
本课题所建立的PCR产物直接测序法能够同时检测HBV逆转录酶区rt169至rt250间的耐药突变位点，具有检测下限低、重复性好、特异性高、简单快捷的特点，联合应用MutationSurveyor软件可提高对低含量耐药变异株检测的灵敏度。
第二部分PCR产物直接测序法检测HBV耐药变异的临床应用
目的
HBV耐药源于长期使用核苷(酸)类似物(NAs)抗病毒治疗过程中HBV逆转录酶(RT)发生突变。到目前为止，这些突变在治疗过程中如何分布和进化的特征还没有被阐明。因此，本研究旨在通过上述建立的PCR产物直接测序法对未接受过治疗和接受过NAs治疗的CHB患者中HBV耐药变异和基因型进行检测，以分析CHB患者RT区突变是否受不同基因型的影响。
方法
应用PCR产物直接测序法对450例慢性乙型肝炎患者的HBV逆转录酶区耐药性突变进行分析，并通过系统进化树鉴定相应的HBV基因型。
结果
408例患者的HBV逆转录酶基因序列扩增成功。系统发育分析显示，HBV基因型B占优势。408例患者的序列分析显示，仅在NAs治疗过的患者中检测到经典的耐药突变位点，且耐药率较高(46.90%，106/226)。HBV基因型B和C患者中仅rtA181T/V突变率存在显著差异，其它经典耐药位点突变率无明显差异。在HBVRT区其它位点的突变率方面，发现了9个基因型相关的氨基酸多态性位点(rt191、rt214、rt221、rt222、rt223、rt224、rt226、rt229和rt238)。其中，大多数位点在未接受治疗的患者中具有较高的突变率(P＜0.05)。
结论
HBV基因型B和C之间存在一定程度的遗传变异，但HBV基因型在抗病毒药物使用过程中驱动耐药性变化的作用有限。
第一部分乙型肝炎病毒逆转录酶区耐药突变检测方法的建立与评价
目的
本研究探讨建立一种检测HBV逆转录酶区10个经典耐药位点的PCR产物直接测序方法。
方法
1建立检测HBV逆转录酶区耐药突变的PCR产物直接测序方法
根据HBV逆转录酶区常见的突变位点，采用PrimerPremier6.0软件设计了覆盖HBV基因型B和基因型C的逆转录酶区rt169至rt250位点的通用引物。以慢性乙型肝炎患者血清HBVDNA作为模板进行PCR扩增，然后通过琼脂糖凝胶电泳和Sanger测序分析PCR产物，以验证目的基因是否被扩增成功。
2包含HBV逆转录酶区rt169至rt250位点的标准质粒的构建
通过掺入EcoRI和HindIII限制性酶切位点的引物扩增HBVDNA模板，然后分别用限制性内切酶EcoRI和HindIII消化纯化的PCR产物和pUC19克隆载体。在使用T4DNA连接酶将这两个酶切后的DNA片段的磷酸二酯键连接在一起之后，下一步是将重组质粒DNA转化至大肠杆菌DH5α菌株的感受态细胞中。然后进行菌落PCR筛选和质粒DNA测序分析，以确定重组质粒标准模板是否构建成功。
3PCR产物直接测序法的评价
将得到的重组菌株扩大培养，并对提取的质粒DNA进行定量和倍比稀释。以各浓度梯度的标准质粒作为DNA模板，重复PCR扩增3次。然后通过1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，以目的条带检出率为100%时的最高和最低模板浓度分别作为该方法的检测上限和下限。通过建立的PCR方法对经Sanger测序验证的rtM204I突变标本连续重复检测10天，分析该耐药位点的突变检出率，以评价该方法的重复性。依据分子克隆方法构建rtM204I突变型重组质粒，将突变型质粒DNA按一定比例混合到野生型质粒中；对混合DNA模板进行PCR扩增，然后应用MutationSurveyor软件对测序结果进行比对分析，以评价该方法对耐药突变株的检测灵敏度。分别对感染了人巨细胞病毒、人乳头瘤病毒、梅毒螺旋体患者和正常受试者的血清DNA样品以及用作空白对照和阳性对照的蒸馏水和质粒标准品进行PCR扩增和目的条带的检测，以评价该方法的特异性。
结果
(1)通过优化PCR扩增体系和条件，建立了一个标准化的PCR方案以检测HBV逆转录酶区的耐药突变位点。50μLPCR扩增体系为：蒸馏水33μL，20mmol/L10×扩增缓冲液(Mg2+plus)5μL，4种dNTP混合物(每种浓度为2.5mmol/L)4μL，ExTaq聚合酶(5U/μL)1μL，上游引物(10μmol/L)1μL，下游引物(10μmol/L)1μL，模板DNA5μL(<500ng)。PCR扩增条件为95℃预变性5min；94℃变性10s，55℃退火20s，72℃延伸1min；循环40次；最后72℃延伸5min。
(2)通过分子克隆技术成功构建了包含有HBV逆转录酶区rt169至rt250位点的野生型标准质粒。
(3)该方法对血清HBVDNA的检测范围为0.36copies/μL至2.88×1011copies/μL，联合应用MutationSurveyor软件可检测出含量低至5%的耐药突变株。同一样本重复10次PCR扩增和测序分析，rtM204I的突变检出率为100%。在空白对照和HBVDNA阴性标本中均未检出目的条带。
结论
本课题所建立的PCR产物直接测序法能够同时检测HBV逆转录酶区rt169至rt250间的耐药突变位点，具有检测下限低、重复性好、特异性高、简单快捷的特点，联合应用MutationSurveyor软件可提高对低含量耐药变异株检测的灵敏度。
第二部分PCR产物直接测序法检测HBV耐药变异的临床应用
目的
HBV耐药源于长期使用核苷(酸)类似物(NAs)抗病毒治疗过程中HBV逆转录酶(RT)发生突变。到目前为止，这些突变在治疗过程中如何分布和进化的特征还没有被阐明。因此，本研究旨在通过上述建立的PCR产物直接测序法对未接受过治疗和接受过NAs治疗的CHB患者中HBV耐药变异和基因型进行检测，以分析CHB患者RT区突变是否受不同基因型的影响。
方法
应用PCR产物直接测序法对450例慢性乙型肝炎患者的HBV逆转录酶区耐药性突变进行分析，并通过系统进化树鉴定相应的HBV基因型。
结果
408例患者的HBV逆转录酶基因序列扩增成功。系统发育分析显示，HBV基因型B占优势。408例患者的序列分析显示，仅在NAs治疗过的患者中检测到经典的耐药突变位点，且耐药率较高(46.90%，106/226)。HBV基因型B和C患者中仅rtA181T/V突变率存在显著差异，其它经典耐药位点突变率无明显差异。在HBVRT区其它位点的突变率方面，发现了9个基因型相关的氨基酸多态性位点(rt191、rt214、rt221、rt222、rt223、rt224、rt226、rt229和rt238)。其中，大多数位点在未接受治疗的患者中具有较高的突变率(P＜0.05)。
结论
HBV基因型B和C之间存在一定程度的遗传变异，但HBV基因型在抗病毒药物使用过程中驱动耐药性变化的作用有限。