基于转录组分析苹果梨表皮蜡质调控Alternaria alternata侵染的分子机制

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本研究以苹果梨采后主要致病菌Alternaria alternata为研究对象,通过ABI STEP ONE PLUS测序方法研究了蜡质处理后A.alternata侵染结构形成过程的转录组,通过生物信息学方法比较了果蜡和蜂蜡处理后A.alternata差异表达基因的GO功能、COG分类和KEGG代谢途径网络,并对主要的差异表达基因进行了qPCR验证;同时通过用各位点的抑制剂处理A.alternata,研究了钙信号途径在梨果蜡质诱导A.alternata侵染结构形成中的调控作用。结果如下:1.通过高通量测序及生物信息学分析,发现在A.alternata孢子萌发阶段(6h),果蜡处理较对照和蜂蜡组分别有56(33个上调、23个下调)和62(35个上调、27个下调)差异表达基因;在A.alternata附着胞形成阶段(12h),果蜡处理较对照和蜂蜡组有127(64上调、63个下调)和260个(140个上调、120个下调)差异表达基因;与果蜡处理后A.alternata的孢子萌发阶段(6h)相比,果蜡处理的A.alternata附着胞形成阶段(12h)有626(486个上、140个下调)基因差异表达。总体上在A.alternata侵染结构形成过程中,A.alternata果响应果蜡表面时的差异基因数目显著低于蜂蜡。2.GO数据库功能注释和富集分析显示果蜡和蜂蜡处理的A.alternata差异表达基因主要富集于细胞组分、分子功能和生物学过程三大类,其中注释到生物学过程中的差异基因最多,主要体现在生物过程中的代谢过程,且果蜡组在GO分析的各功能类别中差异基因均低于蜂蜡组和对照组;COG分类数据库分析表明差异表达基因主要富集在A.alternata的初级代谢、次级代谢、细胞分裂及胞内信号传导等过程。在发育的不同阶段各处理差异表达基因富集的生物过程不同,其中果蜡处理组的细胞分裂及胞内信号传导弱于蜂蜡处理;KEGG代谢途径分析发现在A.alternata孢子萌发及附着孢形成阶段,果蜡组的脂肪酸代谢和过氧化物酶途径中差异基因占比均显著高于蜂蜡组。3.对筛选的与脂肪酸代谢、过氧化物酶体及钙离子信号通路相关的的8个关键差异表达基因进行荧光定量PCR验证,结果显示除磷脂酶C基因外,果蜡处理A.alternata后长链脂肪酸辅酶A连接酶、酰基辅酶A氧化酶、酰基辅酶A脱氢酶,3-酮脂酰辅酶A硫解酶、过氧化物酶体基因PEX2、钙调素基因均上调表达,与转录组测序结果中差异表达的基因上调表达变化趋势基本一致,表明本研究中测序结果比较可靠。4.通过用Ca2+信号转导途径不同位点阻断(抑制)剂处理A.alternata的分生孢子,结果表明钙离子螯合剂(EGTA)、磷脂酶C抑制剂(新霉素)、胞内钙离子通道阻滞剂(TMB-8)、钙调蛋白拮抗剂(W-7)、钙调磷酸激酶抑制剂(环孢菌素A)能显著抑制对照及果蜡刺激的A.alternata孢子萌发和附着胞形成,且抑制作用存在浓度效应。同时发现各抑制剂处理对果蜡诱导A.alternata附着胞形成过程的抑制作用大于孢子萌发,表明钙离子信号途径对果蜡诱导A.alternata附着胞的形成具有重要的调控作用。综上,通过转录组学方法较为全面地解析了果蜡诱导A.alternata侵染结构形成的主要分子机制,发现了一些与其诱导相关的代谢途径及信号通路,为进一步具体阐明A.alternata感知和响应果实表皮蜡质信号进而致病的分子机制提供重要的理论依据。
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