周围神经损伤（Peripheral nerve injury，PNI）通常由事故伤、暴力伤及医源性损伤导致，是临床上最为常见的创伤类型之一。神经缺损（Nervedefect），尤其是长节段的神经缺损（>5cm）是周围神经损伤中创伤最严重、修复最困难、致残率最高的类型。临床上长节段神经缺损的标准治疗模式是借助显微外科技术移植自体神经（通常是皮神经）桥接缺损断端，通过对端吻合的方式进行修复。然而，自体神经移植术的应用通常受到诸多因素的制约，例如：供区所能获取的自体神经移植物的数量、长度及直径有限；二次手术给患者自体神经供区造成的继发性损伤等。此外，目前的显微外科技术已经非常精细，难于产生新的突破；但是神经修复效果仍不满意，有待进一步的改善。近年来，组织工程（Tissue engineering，TE）与再生医学（Regenerative medicine，RM）的交叉结合促进了神经组织工程（Neural tissueengineering，NTE）的发展，为长节段神经缺损的修复开辟了新的途径。周围神经损伤后，神经细胞内在的再生能力被激活，并在损伤后早期即开始再生。自体神经移植物桥接神经缺损的优势在于它能为再生轴突延长和通过缺损区域提供良好的再生微环境（Regenerative microenvironment，RME），即：由细胞外基质构成的基底膜微管结构，为轴突的再生提供物理和分子引导信号；雪旺细胞（Schwann cells，SCs）及其分泌的多种神经营养因子（Neurotrophic factors，NTFs）、细胞粘附分子（Cell adhesion molecules，CAMs）和基底膜组份等，为轴突再生提供物质和营养支持。此外，神经再生需要丰富的血管系统提供充足的营养物质和氧，以及运输代谢产物；适宜的电刺激环境亦有利于激活受损神经细胞，促进轴突生长锥的生发和延展等。因此，在神经修复再生过程中，再生微环境的构建和重新形成扮演着关键角色。目前对于长节段神经缺损修复的研究主要集中在应用组织工程神经支架桥接缺损，并在此基础上结合其他手段如复合细胞或引入神经营养因子构建再生微环境。然而，此类研究大多基于结构相对单一的神经支架，基于高度仿真性能的神经支架构建再生微环境的研究尚少见于报道。本课题立足于具有轴向平行排列的多微管结构的高仿真神经支架，从不同角度探索有利于神经再生的微环境的构建并分别应用于动物神经缺损模型的修复以观察其有效性，构建出两种不同的再生微环境模式，即：⑴、通过移植自体大网膜包裹神经支架，提高神经支架的血管化程度，为神经再生提供充足的营养物质和氧的供给及促进代谢产物的运输；⑵、在神经支架内部种植雪旺细胞，模拟天然神经内部的再生微环境，为神经再生提供必要的神经营养物质支持，提高功能恢复水平。上述研究极大的丰富了神经组织工程学的研究理论，为神经缺损的修复增加了新的有效手段。具体研究内容如下：第一部分：多微管结构高仿真神经支架的制备及相关性能参数检测背景组织工程神经支架有望解决长节段神经缺损修复所面临的一系列难题。然而，目前的神经支架多为相对单一的中空结构，与自体神经内部结构差异较大，神经修复效果欠佳。近年来，在神经支架内部模拟自体神经所特有的基底膜微管结构引导神经再生受到了广泛的关注。本课题组前期制备了具有轴向排列的多微管结构的CCH神经支架，该支架显示了良好的再生轴突的物理引导作用。目的制备CCH神经支架，为下一步实验研究提供结构载体。方法以胶原和壳聚糖为原料，按照课题组前期探索的“梯度冷冻结晶-真空冻干法”制备具有三维立体结构的CCH神经支架，并以京尼平为交联剂进行交联。采用扫描电镜观察支架微观结构，测量其孔隙率、降解率和吸水膨胀率等指标评价支架性能。结果扫描电镜观察显示，本研究制备的神经支架具有轴向平行排列的多微管结构，横截面上呈蜂窝状的多孔结构，高度仿生于自体神经的基底膜微管结构。对其相关性能指标检测显示，该支架具有较高的孔隙率（91.5%）；交联后支架的降解率和吸水膨胀率相对于单纯未交联支架明显降低。结论本研究成功制备了CCH神经支架。该支架原料来源广泛，制备方法易于操作，具有良好的可重复性和稳定的性能指标。CCH神经支架高度仿生于自体神经的基底膜微管结构，在引导轴突再生过程中具有显著的结构优势。第二部分：大网膜包裹CCH神经支架促进神经缺损修复的有效性研究背景在神经支架桥接神经缺损修复再生的研究中，血管化程度不足常常制约神经组织的存活和再生，进而影响神经支架移植的成功率和临床实际应用。大网膜（Great omentum）具有高效的促血管化能力，能够促进组织器官的再生和成熟。目前，联合运用组织工程神经支架和大网膜修复长节段神经缺损、改善轴突再生和功能恢复的研究尚少见于报道。目的探讨移植自体大网膜结合CCH神经支架修复长节段神经缺损的有效性。方法应用CCH神经支架桥接15mm长的大鼠坐骨神经缺损，移植自体大网膜包裹神经支架桥接区域。采用再生神经形态学分析和荧光金（Fluorogold，FG）逆行示踪标记评价神经再生情况；采用坐骨神经功能指数分析（Sciatic function index，SFI）、电生理学评价以及靶肌肉形态学分析评价运动功能恢复情况。结果大网膜包裹CCH神经支架组神经再生水平和运动功能恢复程度显著优于单纯CCH神经支架组，与自体神经组实验结果间无显著性差异。初步进行机制研究发现，与单纯支架组相比，大网膜包裹CCH支架组在修复早期（术后2-4w），其血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）、神经生长因子（Nerve growth factor，NGF）和脑源性神经营养因子（Brain-derived neurotrophic factor，BDNF）的蛋白表达水平显著升高（P<0.05）。结论大网膜包裹神经支架桥接神经缺损能够有效的提高神经再生水平和运动功能恢复程度，其促神经再生效能可能与大网膜分泌的多种生长因子相关。第三部分：CCH神经支架复合雪旺细胞促进神经缺损修复的有效性研究背景自体神经桥接神经缺损的优势在于其具有由细胞外基质构成的基底膜微管结构，为神经再生提供物理和分子引导信号；内部的雪旺细胞及其分泌的多种神经营养因子，为轴突再生提供物质和营养支持。CCH神经支架模拟了自体神经内部的轴向多微管结构，在其三维立体结构内植入雪旺细胞后有望进一步完善其内部的再生微环境，促进受损神经修复再生。目的在CCH支架内部植入雪旺细胞，并将此组合应用于神经缺损修复检验其效能。方法将雪旺细胞植入CCH神经支架进行体外培养，在不同时间观察点（3d，1w，2w）利用扫描电镜观察其粘附、迁移和增殖情况；将植入雪旺细胞的CCH支架用于桥接15mm大鼠坐骨神经缺损，藉此检验该组合促神经缺损修复的效能。神经再生和功能恢复情况分别以再生神经形态学分析、荧光金逆行示踪标记和坐骨神经功能指数分析、电生理学评价以及靶肌肉形态学分析进行评价。结果体外培养3d后，雪旺细胞粘附并迁移到支架内部；2w后细胞数量较前期明显增多。此外，雪旺细胞在支架内沿微管方向延展并形成细胞-细胞间连接，形成类似Büngner带的结构。体内实验结果表明，复合雪旺细胞显著提高了CCH神经支架修复神经缺损的效能，表现为该组的各项神经再生和功能恢复评价指标与自体神经组无显著性差异，并且优于单纯神经支架组。结论CCH神经支架复合雪旺细胞后在为再生轴突提供物理引导结构的同时，极有可能进一步提供了适宜的再生营养环境，因而改善了其自身促神经再生和功能恢复的效能。