烯醇化酶基因的克隆及其在蚊子抗氯菊酯C6/36细胞株中的表达分析

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烯醇化酶是糖酵解中起关键作用的酶,对其的研究主要集中于它在催化2-磷酸甘油酸反应生成磷酸烯醇式丙酮酸过程中的作用,但对其在蚊虫抗药性机制中所起的作用研究较少。本研究根据已获得的致倦库蚊抗性品系与敏感品系差异表达的EST片段(GeneBank号:EC093827.1),设计特异扩增引物,运用RACE技术从淡色库蚊抗性品系中扩增出该基因的全长cDNA序列,并分析其生物信息学特性。结果获得淡色库蚊烯醇化酶基因cDNA全长1311bp序列,编码433个氨基酸。经分析认为该基因编码的蛋白为水溶性蛋白,具有13个主要磷酸化位点。同源比对及系统进化分析表明该基因于不同物种之间较为保守,其氨基酸序列与同属蚊科的致倦库蚊一致性可高达90%以上,并在其保守结构域中含有多个高度保守的氨基酸位点,推测该基因与淡色库蚊的氯菊酯抗性有一定相关性,并初步预测了其在蚊虫产生抗药性过程中的可能机制。本研究还通过逐渐提高细胞培养液中氯菊酯浓度的方法,筛选得到抗氯菊酯的C6/36细胞株,并最终使氯菊酯对C6/36细胞的半抑制浓度从最初的118.4μg/L达到筛选后的984.5μg/L,使C6/36细胞对氯菊酯的抗性提高了8倍。在此基础上,通过实时荧光定量分析技术检测了经筛选得到的氯菊酯抗性C6/36细胞株和氯菊酯敏感性C6/36细胞株之间烯醇化酶基因表达差异。结果表明:烯醇化酶基因在抗性C6/36细胞株中表达上调,是敏感性C6/36细胞株的1.90倍。本研究为进一步阐明烯醇化酶在蚊虫抗药性过程中所起到的作用奠定基础及为研制新型环保蚊虫杀虫剂提供依据。
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