论文部分内容阅读
强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一种慢性进行性自身免疫性疾病。主要侵犯骶髂关节、脊椎关节与附近的肌腱、韧带等软组织。炎症后继发纤维化与钙化。其病变特点表现为起止点（起止点是指肌腱，韧带和关节囊三者连接到骨的地方）和滑膜关节、软骨结合处形成新骨，使脊椎逐渐失去柔软度，严重时会发展到像“竹节”一样无法弯曲或伸展。人们在研究AS病理机制时早已发现，滑膜的病理变化与该病的严重程度密切相关。具体表现为AS髋关节滑膜的慢性滑膜炎、闭塞性血管炎、软骨硬化与骨形成和骨吸收密切相关，髋关节滑膜的增生及其巨噬细胞（尤其是CD163+亚群和多形核白细胞）炎症性渗入与AS的全身性疾病活动也明显相关。为了深入探究病变滑膜在该病中作用机制，本课题组前期利用蛋白质组学方法，以类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA），骨性关节炎（osteoarthritis，OA）为对照，发现碳酸酐酶1（carbonic anhydrase I, CA1）在AS滑膜中特异性高表达。免疫组织化学法和蛋白免疫印迹均证实CA1在AS滑膜中明显表达，AS滑液中同样检测到高表达的CA1。碳酸酐酶1（carbonic anhydrase I,CA1）可以将二氧化碳水化而产生碳酸氢根，进而与钙离子结合形成碳酸钙，而钙盐结晶是骨化过程的重要步骤。因此，该基因的异常表达可能与AS病变关节异常钙化和新骨形成有关。但是，到目前为止还没有生物学证据直接证明CA1参与细胞和体内的生物矿化过程。目的：以骨肉瘤细胞Saos-2为模型，用成骨诱导培养基（osteogenic medium，OM）诱导细胞钙化，通过诱导细胞钙化，观察CA1与细胞钙化之间的关系。本实验同时构建了CA1转基因高表达小鼠，通过胶原诱导关节炎的方法，观察CA1在体内高表达后对异常钙化和关节炎发生的影响。方法：采用成骨诱导培养基诱导人成骨肉瘤细胞Saos-2钙化，然后用茜素红染色法观察细胞矿化结节的形成，用荧光定量PCR检测核心结合蛋白因子2（runt-related transcription factor-2, Runx2）、成骨细胞特异性转录因子（osterix,OSX）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）、骨钙素(osteocalcin,OCN)和骨唾液酸蛋白(bone sialoprotein, BSP)等细胞骨化标志蛋白的表达。采用Western blot和荧光定量PCR检测细胞钙化前后CA1的表达量的变化。同时用碳酸酐酶抑制剂乙酰唑胺处理Saos-2细胞，观察细胞钙化过程是否被抑制。构建转基因CA1高表达小鼠，采用牛II型胶原（bovine type II collagen，CII）进行皮下注射，构建CIA模型，观察CA1转基因组（CA1-Transgenic mouse，CA1-Tg）和对照组（PADI4-Tg和野生型小鼠）小鼠关节炎的发生率，关节肿胀程度，足垫厚度的变化等。并采用X光片观察骨形成和破坏程度，HE染色法检测关节的病理改变，ELISA检测小鼠血清中炎性因子白细胞介素-1α（interleukin-1α，IL-1α）、IL-1β、IL-17和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的含量。结果：Saos-2细胞在OM诱导后形成大量矿化结节，Runx2、ALP、OCN、OSX和BSP转录水平明显升高，显示OM可诱导Saos-2细胞钙化和骨化。Saos-2细胞钙化后CA1表达明显增高。Saos-2细胞经乙酰唑胺处理后，CA1的表达量减少，矿化结节形成明显减少，骨化标志蛋白的表达也明显下降，说明抑制CA1表达可以抑制Saos-2细胞矿化和骨化过程。胶原诱导CA1-Tg和对照组小鼠后发现，CA1-Tg小鼠关节炎的发病率为60%（6/10），对照组PADI4-Tg和野生型小鼠关节炎的发病率为20%（2/10），BSA对照组（0/10）没有出现任何关节炎症状。CA1-Tg小鼠关节炎炎性指数为5.5±0.84，对照组PADI4-Tg和野生型小鼠关节炎炎性指数均小于2。CA1-Tg小鼠的足垫厚度为3.46±0.107mm，明显高于PADI4-Tg小鼠(2.225±0.08mm)、野生型小鼠(2.075±0.06mm)和BSA处理CA1-Tg小鼠。同时，X射线检测发现CA1-Tg小鼠出现明显的关节红肿和僵直，且存在异常钙化和关节融合现象，组织病理学检测发现在其踝关节，膝关节，骶髂关节和抓关节处出现明显的炎症，滑膜组织增生，并伴有严重的骨侵蚀，CA1-Tg小鼠的血清中炎性因子IL-1α、IL-1β、IL-17和TNF-α的表达量明显高于对照组。结论：用成骨诱导培养基诱导骨肉瘤细胞Saos-2矿化后，CA1的表达量明显增高，说明CA1确实参与了细胞的矿化过程。胶原诱导转基因高表达CA1后，转基因小鼠关节炎的发病率和发病程度异常显著，出现明显的关节红肿和僵直，且存在异常钙化和关节融合现象，说明CA1也参与了体内关节处细胞的异常钙化，影响了关节炎的发生和骨的异常吸收、增生及破坏，并为针对CA的特异性抑制剂乙酰脞胺的临床应用提供了理论基础和实验依据。