肝细胞癌(HCC,简称肝癌)是常见的消化系统恶性肿瘤,全球约50%的肝癌发生在我国,位于我国恶性肿瘤死因的第二位,其生物学特征为易复发、转移、死亡率高、预后极差,总的5年生存率仅为5～6%。虽然手术切除仍是可能获得治愈的主要方法,但是术后高复发转移率成为进一步提高患者生存期和改善预后的主要障碍,还有更多的肝癌患者因肿瘤转移而失去手术根治的机会,而抗肿瘤转移的分子靶向治疗有望成为防治肝癌复发转移的新途径。肝癌的发生发展是一个多基因、多步骤参与的复杂动态过程,在这一过程中有多种因素如细胞因子、细胞粘附分子、血管生成因子、细胞外蛋白酶和生长因子等参与了复发转移的过程。肝癌发病机制仍不太清楚,也缺乏特异有效的治疗手段。因此,阐明肝癌侵袭转移与复发的相关分子机制,寻求有效的抗肝癌转移与复发治疗措施,对提高肝癌患者的生存率和改善预后具有重要意义。越来越多的研究表明肿瘤细胞表面表达的趋化因子受体与趋化因子相互作用在肿瘤侵袭和转移中发挥重要作用。趋化因子受体CCR6是CCL20(MIP-3a,LARC, exodus-1,ST38)的受体,是一个高度保守的G蛋白偶联七次跨膜受体。近几年的研究显示CCR6/CCL20生物轴在胰腺癌、前列腺癌、结直肠癌、肺癌和血液系统恶性肿瘤的器官特异性转移中发挥着重要的驱动、导向和定位作用。目前,国内外针对CCR6/CCL20生物轴与肝细胞癌侵袭和转移的关系尚未进行深入系统的研究,针对肝癌CCR6受体蛋白利用小干扰RNA(siRNA)基因治疗尚未见报道。本研究依据microRNA(miRNA)介导的RNA干扰(RNAi)原理,以高转移潜能的人肝癌细胞系HCCLM6为研究对象,应用pGPH1/GFP/Neo质粒作为载体研究下调CCR6基因表达对肝癌细胞侵袭转移能力的影响,筛选干扰CCR6基因的有效干扰序列,初步探讨以CCR6为靶点抑制肝癌侵袭转移的可行性及其作用机制。通过Real-time PCR、免疫组化法、Western-blot及细胞免疫荧光检测48对肝癌/癌旁组织、8例正常肝组织和6种肝/肝癌细胞系CCR6/CCL20基因及蛋白的表达,并分析CCR6/CCL20表达与肝癌临床病理特征及预后的关系。Real-time PCR和免疫组化的方法检测48对肝癌/癌旁和8例正常肝组织CCR6/CCL20的表达水平。结果发现肝癌组织CCR6mRNA的表达水平明显高于癌旁组织和正常肝组织,相对表达量分别为0.99±0.21,0.33±0.09和0.22±0.06,组间两两比较差异有统计学意义(P﹤0.05)。CCL20mRNA的相对表达量分别为0.46±0.11,0.31±0.07和0.28±0.05,癌组织的平均表达水平高于癌旁组织和正常肝组织,差异有统计学意义(P﹤0.05)。免疫组化检测结果发现CCR6蛋白在肝癌组织的阳性表达率(54.17%)显著高于癌旁组织(16.67%)和正常肝组织(未见明显阳性表达),差异有统计学意义(P﹤0.05);肝癌组织CCL20的阳性表达率(50.00%)高于癌旁组织(33.33%)和正常肝组织(25.00%),但差异无统计学意义(P﹥0.05)。Spearman相关性分析显示,CCR6和CCL20在肝癌组织的阳性表达具有一定的相关性(相关系数=0.42, P﹤0.05)。分析肝癌组织CCR6/CCL20蛋白的表达与临床病理特征如性别、年龄、肝硬化、肿瘤大小、分化程度、pTNM分期、脉管癌栓、肝内转移和肺转移之间的关系。结果显示:CCR6的阳性表达率在肝癌的pTNM分期、脉管癌栓、肝内转移和肺转移方面差异有统计学意义(P﹤0.05),而与患者性别、年龄、是否肝硬化及肿瘤大小、分化程度无明显相关性(P﹥0.05)。CCL20的阳性表达率仅在肝癌的肿瘤大小、pTNM分期方面差异有统计学意义(P﹤0.05)。生存分析结果显示CCR6阳性表达组肝癌的无瘤生存率(DFS)和总体生存率(OS)显著低于CCR6阴性表达组(P﹤0.05);与CCL20阴性表达组相比,CCL20阳性表达组的无瘤生存率和总体生存率差异无统计学意义(P﹥0.05)。通过Real-time PCR和Western-blot检测CCR6/CCL20基因及蛋白在6种肝/肝癌细胞系中的表达,发现5种肝癌细胞系(SMMC-7721, MHCC-97L, MHCC-97H, HCCLM3和HCCLM6)均有不同程度的CCR6表达,且表达量随转移潜能的增强而增加,以HCCLM6肝癌细胞系的表达量最高,而肝细胞系L02几乎不表达。另外,L02和5种肝癌细胞系均有不同程度CCL20的表达,而表达量无明显差异(P﹥0.05)。通过细胞免疫荧光法发现CCR6的阳性表达主要位于肝癌细胞系HCCLM6胞膜和胞浆,表达呈现均一性。上述结果表明CCR6/CCL20生物轴,尤其是CCR6在肝癌的进展中发挥重要作用,抑制CCR6基因的表达将可能达到控制肝癌侵袭转移的目的。第二部分抑制人肝癌细胞系CCR6表达的siRNA序列筛选及稳定转染细胞株建立针对CCR6基因的siRNA干扰序列,Lipofectamine2000体外转染高表达CCR6的HCCLM6肝癌细胞系,荧光显微镜观察细胞转染率;Real-time PCR和Western-blot检测CCR6基因及蛋白的抑制效率,通过G418筛选并建立稳定转染细胞株。结果表明质粒DNA量从0.4ug增加到2.4ug,转染率逐渐增高,再增加质粒DNA剂量转染率并不增加,以Lipofectamine2000 2.0μl,质粒DNA为1.6ug时转染效率最高,瞬时转染48h后,转染率均达到85%以上。瞬时转染pGPH1/GFP/Neo-(CCR6-siRNA-431、-1098、-673、-493)48小时后,我们发现各转染组CCR6mRNA均有不同程度的干扰效应,在转染后72～96小时达到高峰。CCR6-siRNA-493组的CCR6mRNA水平下降最为显著,表达量较其它各干扰组明显减少(P﹤0.05),抑制率达90%以上,而各对照组CCR6mRNA表达量无明显变化。Western-blot检测结果显示各干扰组CCR6蛋白均有不同程度的表达抑制,转染后96～120小时CCR6-siRNA-493组的CCR6蛋白表达量最低,与Real-time PCR结果一致。根据质粒载体含有的抗性基因(Neo),我们进一步通过G418筛选并建立稳定转染细胞株。以上结果表明,CCR6-siRNA-493在基因及蛋白水平均能明显抑制肝癌细胞CCR6的表达且干扰效果最佳,故选择CCR6-siRNA-493进入后续实验。第三部分CCR6-siRNA对肝癌细胞HCCLM6生物学行为的影响及其机制探讨本部分实验通过前部分建立的稳定转染CCR6-siRNA的细胞株观察沉默CCR6基因表达的人肝癌细胞株生物学行为的变化,检测是否有效抑制人肝癌细胞增殖、迁移和侵袭能力,减少肝癌细胞的恶性表型,并初步探讨其机制,为下一步动物体内实验奠定基础。MTT法结果显示,CCR6-siRNA转染组细胞的增殖速度明显低于HCCLM6-Mock组和HCCLM6-Scrambled组。纤维连接蛋白(FN)粘附实验发现培养30分钟后CCR6-siRNA组细胞的粘附率(24.51%)较HCCLM6-Mock组(68.27%)和HCCLM6-Scrambled组(64.96%)明显降低(P﹤0.05)。划痕实验显示CCR6-siRNA组细胞24小时和72小时的划痕修复率明显低于HCCLM6-Mock组和HCCLM6-Scrambled组(P﹤0.05)。Transwell小室试验显示CCR6-siRNA组穿透人工基底膜细胞数明显低于对照组(P﹤0.05),趋化因子CCL20可显著增加HCCLM6细胞的趋化运动能力,在一定浓度范围内,CCL20对肝癌细胞的趋化作用同浓度呈正相关而对CCR6-siRNA细胞无明显趋化作用。明胶酶谱法检测发现CCR6-siRNA组细胞中MMP-2、MMP-9的分泌均明显下调,尤以MMP-2下调显著。此外,CCR6-siRNA组细胞PCNA、ICAM-1和OPN蛋白表达较对照组明显减少(P﹤0.05),而E-cadherin的表达无明显差异。以上结果表明,CCR6-siRNA能够抑制肝癌细胞的增殖、粘附、迁移和侵袭能力,或可成为治疗肝癌的潜在靶点。第四部分荷瘤裸鼠模型建立及CCR6-siRNA对肝癌细胞体内生长的作用为了进一步研究CCR6-siRNA对肝癌的治疗作用,我们在BALB/c裸鼠体内建立人肝癌皮下移植瘤模型。通过观察移植瘤的生长、侵袭、转移情况,对CCR6-siRNA治疗肝癌的作用作出评价。裸小鼠18只,随机分为3组,于每只裸鼠右侧背部皮下接种不同转染处理的细胞(6×106/0.2ml),接种5周后终止实验。CCR6-siRNA组、HCCLM6-Mock组和HCCLM6-Scrambled组裸鼠成瘤潜伏期分别为21.45±4.52天、12.83±2.61天和13.96±3.43天,CCR6-siRNA组成瘤时间明显延长(P﹤0.05)。成瘤后CCR6-siRNA组裸鼠肿瘤的生长速度明显慢于对照组,至实验结束时,CCR6-siRNA组肿瘤体积和瘤重分别为314.17±93.42mm3、0.71±0.22g,与对照组843.92±291.08mm3、1.55±0.38g和809.08±263.74mm3、1.43±0.29g相比较,差异有统计学意义(P﹤0.05)。HE染色观察裸鼠肝肺组织转移灶发现CCR6-siRNA组肝肺转移灶相对较小且数目较对照组明显减少,差异有统计学意义(P﹤0.05)。移植瘤组织免疫组化法检测发现CCR6-siRNA组VEGF、MMP-2、MMP-9的表达积分及MVD值明显低于HCCLM6-Mock和HCCLM6-Scrambled组,差异有统计学意义(P﹤0.05)。以上结果表明,CCR6对肝癌的发展具有重要作用, CCR6-RNA基因治疗能够有效地抑制肿瘤体内的生长转移,CCR6可成为肝癌基因治疗的新靶点。