第一部分载纳米炭的光声/超声双模态相变纳米粒的制备及性能检测目的制备一种载纳米炭(CNs)及液态氟碳(PFH)的聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)光声/超声双模态相变纳米粒(CNPs),并对其光学、物理学、液气相变及生物安全性等性能的检测。方法采用双乳化法制备出CNPs,对其形态、内部结构,粒径、zeta电位,吸收光谱进行检测,经激光辐照后光镜对比辐照前后的形态变化;制备出Di I标记的CNPs(Di I-CNPs),与巨噬细胞(RAW264.7)孵育,观察不同时间内(3 h,12 h,24 h)Di I-CNPs被巨噬细胞吞噬的情况及吞噬CNPs对巨噬细胞活性的影响。结果CNPs溶于双蒸水后呈深黑色;在光镜下观察,CNPs呈较规则的球形,大小均一性较好,分散度好,经激光辐照发生液气相变后体积明显增大;在透射电镜下可见灰黑色的液态氟碳包裹于PLGA囊内,而纳米炭分布于白色PLGA外壳中;Malvern激光粒径仪检测出CNPs平均粒径为483.6±42.11 nm,Zeta电位为-26.3±5.02 m V;分光光度计检测出CNPs在400-900 nm波长范围内均有较好的光吸收性,并且与CNs相似;体外吞噬实验显示,RAW264.7细胞于体外能够吞噬CNPs;CCK-8法测得被吞噬后的CNPs对细胞活性无明显影响。结论成功制备出呈球形、形态较规则,大小较均一,性质稳定,生物安全性好的载CNs和PFH的PLGA高分子纳米粒(CNPs)。该纳米粒继承了CNs良好的光学吸收性能,具备了增强光声/超声显像的潜能,从而具备了成为一种新型的双模态造影剂的潜能。第二部分载纳米炭的光声/超声双模态相变纳米粒增强超声、光声显像及染色淋巴结的实验第一节载纳米炭的光声/超声双模态相变纳米粒体外双模态显像实验目的观察不同浓度CNPs体外增强光声及超声成像的效果,探讨其作为双模态造影剂的可行性。方法以2%琼脂糖凝胶为载体制备孔洞模型,装载不同浓度的CNPs(5,10,15 and 20 mg/ml),利用光声成像仪,以波长为700 nm的脉冲激光激发,获取不同浓度CNPs的光声图像及信号值,用以分析CNPs浓度与光声信号值的关系。同法以不同浓度CNPs(5,10,15 and20 mg/ml),用激光仪(808 nm,1 W/cm2)分别辐照10 s后,用彩色多普勒超声诊断仪获取增强超声显像的图像,并以DFY超声图像分析软件获取图像的平均灰度值,用以分析CNPs浓度与平均灰度值得关系。结果经700 nm激光激发,CNPs能够产生较强的光声信号,且光声信号值随CNPs浓度的增加,呈现增强的趋势,且与其图像所表现一致。经激光仪(808 nm,1 W/cm2)辐照后,CNPs呈高回声,随着CNPs浓度增加,回声强度呈现增强趋势,经DFY分析不同浓度图像ROI的平均灰度值,与其图像所表现一致。结论CNPs具有在体外增强光声及超声双模态显像的能力,且这种增强效果随CNPs浓度增加有增强的趋势。因此,CNPs具备成为光声/超声双模态造影剂的潜能。第二节载纳米炭的光声/超声双模态相变纳米粒体内双模态显像实验目的观察CNPs在体内对淋巴结光声及超声显像增强的效果,探讨其作为双模态造影剂的可行性及了解其在不同时间点增强的规律。方法建立兔VX2腘窝淋巴结转移模型,于肿瘤种植3 w后至腘窝可扪及肿大淋巴结开始实验。实验组:随机取3只VX2兔静脉麻醉后分别在患肢足垫注射CNPs,剂量为(2 ml,20 mg/ml),以波长为700nm的脉冲激光激发,获取注射前以及注射后不同时间点(pre,15 min,1h,24 h,48 h)的光声图像及信号值。在了解CNPs显影的时间规律后,再取9只VX2兔随机分为三组:CNPs组、CNs组、空白纳米粒组(NPs,PLGA载PFH,无CNs),CNPs组剂量同前,CNs组剂量为(2 ml,与CNPs的CNs浓度相同),NPs组剂量为(2 ml,与CNPs的PLGA浓度相同),同样以波长为700 nm的脉冲激光激发,获取注射前以及注射后不同时间点(pre,15 min,1 h,24 h)的光声图像及信号值。随机取3只VX2兔静脉麻醉后分别在患肢足垫注射CNPs(剂量同前),以彩色多普勒超声诊断仪获取注射前以及注射后不同时间点(pre,15 min,30 min,1 h,2 h)的二维及增强超声图像,每次获取图像前用激光仪(808 nm,1 W/cm2)辐照淋巴结位置30 s。在了解CNPs的显影时间规律后,再取9只VX2兔随机分为三组:CNPs组、CNs组、NPs组(剂量同前),以彩色多普勒超声诊断仪获取注射前以及注射后不同时间点(pre,15 min,30 min,1 h)的二维及增强超声图像,同样每次获取图像前用激光仪(808 nm,1 W/cm2)辐照淋巴结位置30 s。以DFY超声图像分析软件获取图像ROI的平均灰度值以定量分析。结果在光声显影下,15 min开始出现淋巴结光声显影增强,而1 h左右淋巴结整个轮廓得以显现,24 h光声显影增强最明显,48 h仍有较强的增强;相比之下,CNs与CNPs的光声显影效果类似,而NPs无增强光声显影的作用。定量分析光声值,与图像显示一致。在超声显影下,15 min开始出现淋巴结超声显影增强,而30 min增强最明显,1 h和2 h仍有较明显的增强;相比之下,CNs和NPs均无增强超声显影的作用。定量分析ROI平均灰度值,与图像显示一致。结论CNPs具有在体内增强淋巴结光声及超声双模态显像的能力,且CNPs增强淋巴结的双模态显影具有时间依耐性。因此,CNPs具备成为增强淋巴结光声/超声双模态显像的造影剂的能力。第三节载纳米炭的光声/超声双模态相变纳米粒染色淋巴结及体内吞噬实验目的观察CNPs染色淋巴结的情况及淋巴结内巨噬细胞吞噬CNPs的情况,探讨CNPs是否具有染色淋巴结的能力和巨噬细胞吞噬作为一种CNPs进入淋巴结的途径的可能性;观察进入淋巴结的CNPs是否引起急性炎症反应,探讨其体内的生物安全性。方法建立兔VX2腘窝淋巴结转移模型,于肿瘤种植3 w后至腘窝可扪及肿大淋巴结开始实验。取6只VX2兔随机分两组,每组3只,静脉麻醉后分别在患肢足垫注射CNPs(2 ml,20 mg/ml)和生理盐水(2ml),生理盐水组作为对照组。1 h后解剖淋巴结,观察其染色的情况。另随机取3只VX2兔,同法注射CNPs(2 ml,20 mg/ml),48 h后,切取目标淋巴结,而后以福尔马林浸泡注射CNPs的淋巴结,切片后HE染色行病理检查。结果注射CNPs的淋巴结呈肉眼清晰可见的黑色,而生理盐水组的淋巴结未染色,两者清晰可辨。染色的淋巴结经切片、HE染色后镜下观察可见较多的巨噬细胞吞噬大量的CNPs,肿瘤细胞周围也可见较多CNPs,而且镜下均未见中性粒细胞浸润,无急性炎症反应。结论CNPs经皮下注射后可染色淋巴结,有利于淋巴结的探查。CNPs在体内也是可以被巨噬细胞吞噬的,这也可能是一种CNPs进入淋巴结的重要途径,而且CNPs并不引起淋巴结的急性炎症反应。第三部分载纳米炭的光声/超声双模态相变纳米粒体内外光热治疗实验目的观察CNPs、CNs、NPs经激光辐照后在体外对乳腺癌细胞的抑制效果,探讨CNPs产生的光热效应在体外的治疗作用;观察CNPs、CNs、NPs经激光辐照后在体内对转移淋巴结的抑制效果,探讨CNPs产生的光热作用在体内对转移淋巴结的治疗作用。方法以CNPs(20μL,20 mg/ml),NPs(20μL,与CNPs的PLGA浓度相同),CNs(20μL,与CNPs的CNs浓度相同),分别与MDA-MB-231细胞共孵育12 h,然后分别用激光仪(808 nm,1 W/cm2)辐照30 s、60 s及120 s,按加入材料不同分为3大组,每组按照辐照时间不同再分为3小组,共9组。流式细胞仪分别检测这9组MDA-MB-231细胞的凋亡率。建立兔VX2腘窝淋巴结转移模型,于肿瘤种植3 w后至腘窝可扪及肿大淋巴结开始实验。静脉麻醉后分别在患肢足垫注射CNPs、CNs、NPs;CNPs剂量为(2 ml,20 mg/ml),CNs剂量为(2 ml,与CNPs的CNs浓度相同),NPs剂量为(2 ml,与CNPs的PLGA浓度相同),然后分别用激光仪(808 nm,1 W/cm2)辐照2 min,4min,8 min。按加入材料不同分为3组,每组按照辐照时间不同再分为3组,共9组。激光辐照结束后,解剖并取出淋巴结,福尔马林浸泡,切片、HE染色,行病理检查,了解其肿瘤细胞坏死、凋亡情况。激光辐照后1 w,观察激光辐照后皮肤的颜色有无改变、有无坏死、溃疡形成。结果CNPs组随着辐照时间增加,MDA-MB-231细胞的凋亡率增加;CNPs组在不同辐照时间情况下的凋亡率均明显高于NPs组(P<0.05),而CNPs组在不同辐照时间情况下的凋亡率稍高于CNs组(P<0.05)。NPs组经不同时间激光辐照后,其转移病灶内肿瘤细胞均无明显坏死、凋亡情况;而CNPs组及CNs组在不同时间激光辐照后,其转移病灶内肿瘤细胞均有明显凋亡,而随着辐照时间增加,其凋亡的范围也有明显增加。辐照1周后,观察其辐照部位皮肤无发红,无坏死,无溃疡形成。结论CNPs在激光辐照后产生光热作用,在体外对乳腺癌细胞产生了明显的抑制作用,并随着辐照时间延长,其抑制作用增强。CNPs能在体内产生明显的光热作用,并对转移淋巴结有明显的抑制作用,且随着激光辐照时间的增加,其抑制作用增强。同时,该激光能量对照射的皮肤未造成红肿、坏死及溃疡形成,也证实该激光能量的安全性。