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烟草是国家财税收入的重要来源之一,烟草行业是影响中国经济最广泛的行业。马铃薯Y病毒(Potato virus Y, PVY)是烟草上危害最为严重的病毒之一。根据生物学症状、血清学反应特性和核苷酸序列,可将PVY分为不同的株系:普通型(Commonor Ordinary strain,PVYO),烟草叶脉坏死型(Tobacco veinal necrosis strain,PVYN),点条斑型(stipple streak strain,PVYC)以及PVYZ和PVYE。病毒株系和品种的不同,表现出的症状特点也有明显的差异。较为普遍的PVYO侵染烟草,在发病初期,叶片会出现“明脉”,后网脉的脉间则颜色变浅,表现为花叶症状;PVYN侵染烟草,病株叶脉则变成暗褐色至黑色坏死,叶片呈现污黄褐色,有时候坏死部分则延伸至主脉和茎的韧皮部,表现为脉坏死症状。二者在致病症状上有明显差异,目前对马铃薯Y病毒普通株系和致死株系致病差异性的机理尚不明确。 从山东感病的烟草中分离得到两个PVY分离物,分别命名为PVY-T和PVY-G。5 RACE(Rapid-amplification of cDNA ends,RACE)及RT-PCR(Reverse transcriptionPCR, RT-PCR)克隆两个PVY分离物的基因组全序列。比对PVY-T、PVY-G全基因组序列发现,全基因组序列都为9665个核苷酸,PVY-T的全基因组序列的5-非翻译区由170个核苷酸组成,ORF含有9183个核苷酸,编码3061个氨基酸,3-非翻译区包含312个核苷酸。而PVY-G的全基因组序列的5-非翻译区由164个核苷酸组成,ORF含有9171个核苷酸,编码3057个氨基酸,3-非翻译区包含330个核苷酸。二者的全基因组核苷酸序列一致率为88.96%,氨基酸序列一致率94.35%。一致率差异较大部分为P1、HC-Pro、NIa-VPg、NIa、NIb5个蛋白。氨基酸序列的进化树分析表明,PVY-T分离物属于PVYN株系,PVY-G分离物属于PVYO株系。 利用Solexa高通量测序技术,对两个马铃薯Y病毒分离物侵染后的烟草叶片和健康的叶片的cDNA文库进行差异基因表达谱分析,结果显示,在三个数据库中分别测出了9,923,807、8,749,219、6,805,228个序列。PVY-T侵染的烟草植株相比对照植株(T-CK)有2221个上调和432个下调的基因;PVY-G侵染的烟草植株相比对照植株(G-CK)有2118个上调和716个下调的基因,进一步比较PVY-T处理组与PVY-G处理组(T-G)的测序结果,发现有241个上调和33个下调的基因,其中未知基因约占14.6%。通过比较T-CK与G-CK,我们发现,有5个基因在高通量测序结果中表现为异向调控:过氧化物酶、新薄荷还原酶、假设蛋白POPTRDRAFT_783792、CP12、LTP1前体。它们的异向调控表明PVY-T、PVY-G侵染植株后导致了寄主部分基因的异向表达,这些基因的异向表达可能是N株系与O株系侵染植株后产生不同症状的原因。 通过基因功能分析表明,差异表达基因广泛涉及新陈代谢、次生代谢、RNA运输等过程。利用qRT-PCR技术检测了6个差异显著基因的相对表达量,结果显示6个基因表达水平的差异性与高通量测序结果一致。这些基因的表达水平发生明显变化,表明病毒侵染植株后导致了植株基因的表达差异,这些基因的上调或下调影响植株的抗病表现。