小鹅瘟单克隆抗体的制备及其鉴定

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小鹅瘟(Gosling Plague, GP)又称鹅细小病毒病,最早的时候是由我国教授方定一于1956年发现并用鹅胚分离到小鹅瘟病毒(Goose Parvovirus, GPV)。此病主要是导致30日龄内的雏鹅与雏番鸭感染发病,雏鹅在10日龄的发病和死亡率能达到100%,此病是一种传播速度极快和死亡率很高的烈性传染病。小鹅瘟的诊断是目前学者们普遍关注的问题,并且这一问题直接关系养鹅业的发展。本试验纯化了GPV病毒并且对目的基因片段VP3进行了扩增、克隆和鉴定,同时将所得序列与已发表GPV的VP3序列的同源性进行了比较,结果同源性在95.8%-99.5%之间,说明所克隆片段是所需要的目的片段。本试验继续用纯化的GPV病毒当做抗原对BALB/C小鼠进行免疫并借此建立出间接ELISA方法用来对阳性杂交瘤细胞株进行筛选,在经过反复的试验后确定了用来进行间接ELISA筛选方法的最佳反应条件,即用纯化的GPV当做抗原以1:1600稀释,包被过夜在4℃,阴阳性对照分别采用1:200稀释阴、阳性血清,以37℃1h为反应条件最好,酶标二抗以1:2000作为工作浓度稀释。取免疫BALB/C小鼠的脾脏与培养的骨髓瘤细胞做融合,用建立成功的间接ELISA方法对融合成功的杂交瘤细胞进行筛选检测,经过初检、二检和三检共获得6株阳性杂交瘤的细胞株,又用有限稀释法对阳性细胞株进行了3-4次的亚克隆(其中最少两次是单克隆)后获得了2株能稳定的分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,将其分别命名为5F11、3C11。对这2株杂交瘤细胞株的腹水效价、亚类、染色体数、特异性和稳定性进行了鉴定,结果如下:经过连续传代20余次和冻存后120天复苏检测,细胞株分泌McAB差异不显著,稳定性很好;染色体数均介于100~110之间,具有典型杂交瘤细胞的染色体特征;经单克隆抗体亚型鉴定,5F11、3C11杂交瘤分泌的抗体类型均为IgG1;单抗腹水效价分别为分别为1:819200,1:1638400;并具有很好的特异性。
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