研究背景和研究目的:　　 结直肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,发病率呈逐年上升和年轻化趋势。转移是导致结直肠癌患者死亡的主要原因。因此,阐明结直肠癌转移的分子机制,控制转移是当前结直肠癌研究的主要方向。　　 最近Formins家族蛋白作为细胞骨架装配和组建的关键调控分子已引起人们的广泛关注。FMNL2是最近发现的一个Diaphanous相关的formins(DRFs)亚家族成员。前期工作中,我们利用体内筛选法获得了具有高肝脏转移特征的结直肠癌细胞株SW480的亚系SW480/M5,并比较了两者基因芯片的差异表达情况,从中筛选出在高转移潜能细胞中表达升高的FMNL2基因作为一个研究结直肠癌侵袭、转移的新靶点。本课题组朱曦龄博士首次探讨了FMNL2与结直肠癌侵袭、转移的关系及分子机制,发现FMNL2在结直肠癌细胞株和组织中高表达,且与淋巴结转移相关；FMNL2沉默后抑制结直肠癌细胞的体外生长、运动、侵袭及体内肝转移能力。进一步的研究发现,将FMNL2基因沉默后,与细胞运动相关的RhoA/ROCK信号通路蛋白的表达均降低。由此我们推断,FMNL2可能通过Rho细胞运动信号通路促进结直肠癌的侵袭和转移。然而FMNL2转染是否影响结直肠癌侵袭和转移过程?FMNL2和Rho蛋白之间存在怎样的调控关系?FMNL2参与Rho细胞运动信号通路的哪个作用环节?FMNL2与哪些靶蛋白发生相互作用?以上问题尚不清楚。　　 本研究在此基础上,探讨FMNL2转染对结直肠癌细胞侵袭和转移的影响,验证FMNL2参与结直肠癌Rho细胞运动信号通路的这一设想,确定FMNL2在通路中的作用环节和关键作用蛋白。旨在阐述FMNL2参与Rho细胞运动信号通路的新途径,揭示FMNL2参与结直肠癌转移的新机制。　　 研究方法:　　 1 FMNL2-CT功能段及-NT调控段过表达对结直肠癌细胞体内外生物学特性的影响　　 (1)构建重组质粒载体pcDNA3-Flag-FMNL2-CT,将商品化的FMNL2-CT过表达重组慢病毒颗粒感染结直肠癌细胞株SW480和HT29,用慢病毒空载体做对照,利用有限稀释法筛选并获得FMNL2-CT过表达的单克隆稳定细胞株,用Q-PCR和Western blot检测转染效率；　　 (2)构建重组质粒载体pcDNA3-Flag-FMNL2-NT,利用阳离子脂质体法将之转染低表达FMNL2的SW480和HT29细胞株中,用pcDNA3-Flag质粒载体转染做对照,培养24后行Q-PCR检测,48h后用Western blot检测转染效率；　　 (3)利用MTT实验、平板克隆形成实验、同质粘附实验、FN粘附实验和侵袭实验检测FMNL2-CT和-NT过表达对体外细胞增殖、粘附及侵袭能力的影响；　　 (4)应用整体可视化动物模型,检测FMNL2-CT段过表达对结直肠癌细胞裸鼠皮下成瘤和肝转移能力的影响。　　 2 FMNL2-CT过表达、FMNL2沉默及C3、Y27632、LatB分别处理FMNL2-CT过表达细胞对Rho细胞运动信号导通路的影响　　 (1)利用Rho pull-down assay和Western blot检测FMNL2-CT过表达,结直肠癌细胞中Rho(-A,-B,-C)的活性和总蛋白含量变化；RhoA/Rock信号转导通路三种效应蛋白(P-MLC,P-LIMK,P-Cofilin)的表达变化；　　 (2)应用Western blot检测稳定转染FMNL2-siRNA1和-siRNA2的SW620细胞中FMNL2的干扰效率(该细胞由李静宇馈赠)；　　 (3)利用Rho pull-down assay和Western blot检测,观察FMNL2沉默后的SW620细胞中RhoA活性和P-MLC、P-LIMK、P-Cofilin的表达变化；　　 (4)采用双荧光素酶报告系统分析FMNL2-CT过表达、FMNL2沉默对SRF转录活性的影响；　　 (5)利用荧光标记的鬼笔环肽检测,分析FMNL2-CT过表达、FMNL2沉默对细胞内肌动蛋白聚合能力的影响；　　 (6)分别用Rho活性抑制剂C3转移酶及ROCK活性抑制剂Y27632处理FMNL2-CT过表达细胞后,检测结直肠癌细胞中活性RhoA和P-MLC,P-LIMK,P-Cofilin的表达变化及其对细胞内肌动蛋白聚合能力和体外侵袭能力的影响；分别用C3转移酶及SRF活性抑制剂LatB处理后,检测FMNL2-CT过表达细胞SRF转录活性的变化。　　 3 FMNL2及其相互作用蛋白在RhoA/Rock通路活化中的作用机制　　 (1)利用10μM的LPA处理FMNL2干扰细胞,利用Rho pull—down assay和Western blot检测,观察LPA对结直肠癌细胞中活性RhoA、P-MLC、P—LIMK和P-Cofilin表达的影响；　　 (2)利用10μM的LPA处理FMNL2干扰细胞,采用荧光标记的鬼笔环肽检测LPA对FMNL2干扰细胞肌动蛋白聚合能力的影响；采用双荧光素酶报告系统检测LPA对FMNL2干扰细胞SRF转录活性的影响；采用体外侵袭实验,检测LPA对FMNL2干扰细胞体外侵袭能力的影响。　　 (3)利用免疫共定位和免疫共沉淀方法检测FMNL2与LARG(即leukaemia-associated RhoGEF)和p115RhoGEF的相互作用关系；　　 (4)应用阳离子脂质体法,将LARG-shRNA转染至结直肠癌SW620和HT29/FMNL2-CT细胞株中,用无关干扰序列载体转染做对照,培养48h后Western blot检测LARG干扰效率；　　 (5)利用Western blot检测LARG干扰后,结直肠癌细胞中RhoA、p-MLC和p-LIMK的表达变化；　　 (6)采用侵袭实验检测LARG基因干扰对细胞体外侵袭能力的影响。　　 研究结果：　　 1 FMNL2-CT功能段及-NT调控段过表达对结直肠癌细胞体内外生物学特性的影响　　 (1)分别获得4个稳定过表达FMNL2-CT的SW480和HT29细胞克隆株,Q—PCR和Wegern blot结果显示,FMNL2-CT mRNA(分别为15.439～18.085倍和12.579～15.563倍)和蛋白在SW480/FMNL2-CT和HT29/FMNL2-CT克隆细胞中的表达显著高于mock对照组细胞；获得瞬时过表达FMNL2-NT的SW480和HT29细胞,Q-PCR和Western blot结果显示FMNL2-NT mRNA(分别为24.281倍和20.819倍)和蛋白在SW480/FMNL2-NT和HT29/FMNL2-NT中的表达显著高于mock对照组；　　 (2)MTT法和平板克隆形成实验结果显示FMNL2-CT过表达显著促进结直肠癌细胞的体外增殖能力(分别F=1810.772,P=0.000；F=692.528,P=0.000和F=39.221,P=0.000；F=38.242,P=0.000):FMNL2-NT过表达对结直肠癌细胞的体外增殖能力无显著影响(分别F=0.010,P=0.926 F=0.062,P=0.804和F=0.000,P=0.991;F=0.000,P=1.000)；　　 (3)同质粘附实验和FN粘附实验结果显示,FMNL2-CT过表达对结直肠癌细胞的同质粘附能力及对FN的异质粘附能力均无影响(分别F=0.204,P=0.819；F=0.439,P=0.657和F=0.078,P=0.925;F=0.554,P=0.586);FMNL2-NT过表达对结直肠癌细胞的同质粘附能力及对FN的异质粘附能力均无显著影响(分别F=0.219,P=0.659；F=1.548,P=0.269;F=0.055,P=0.819;F=0.118,P=0.738);　　 (4)侵袭实验结果显示FMNL2-CT过表达促进结直肠癌细胞的体外侵袭能力(分别F=18.589,P=0.000；F=53.988,P=0.000)。FMNL2-NT过表达抑制结直肠癌细胞的体外侵袭能力(分别F=83.748,P=0.000；F=10.043,P=0.013)；　　 (5)裸鼠皮下成瘤和脾注射法肝转移实验结果显示,FMNL2-CT过表达显著提高了结直肠癌细胞的体内增殖能力(分别提高1.8倍和1.68倍)和肝转移能力(肝转移率从50％或30％提高到100％)。　　 2 FMNL2-CT过表达、FMNL2功能沉默及C3、Y27632、LatB分别处理FMNL2-CT过表达细胞对Rho细胞运动信号通路的影响　　 (1)Rho pull-down assay和Western blot结果显示FMNL2-CT过表达后,细胞中RhoA、RhoC活性升高,但总蛋白量无显著变化；RhoB的活性和蛋白量无显著变化；Phospho-Cofilin,Phospho-LIMK,Phospho—MLC表达升高；　　 (2)Western blot结果显示与SW620/scrambled细胞相比,SW620/FMNL2/SiRNA1和/siRNA2细胞中FMNL2蛋白的表达明显下降；　　 (3)FMNL2沉默后细胞中RhoA/ROCK信号通路蛋白RhoA—GTP,P-Cofilin,P—LIMK,P-MLC表达降低；　　 (4)双荧光素酶报告系统结果显示,FMNL2过表达后细胞中SRF的转录活性显著提高(分别F=1286.604,P=0.000；F=1334.975,P=0.000);FMNL2沉默后细胞中SRF的转录活性显著降低(F=368.815,P=0.000)。鬼笔环肽荧光标记结果显示FMNL2-CT过表达后细胞中F-actin的含量增多；FMNL2沉默后细胞中F-actin的含量减少;　　 (5)用Rho活性抑制剂C3转移酶处理FMNL2-CT过表达细胞后,细胞中活性RhoA、P-MLC、P-LIMK、P-Cofilin表达降低。用ROCK活性抑制剂Y27632处理FMNL2-CT过表达细胞后,细胞中活性RhoA的含量无明显变化,P—MLC、P-LIMK、P-Cofilin表达均降低。用C3转移酶或Y27632处理FMNL2-CT过表达细胞后,细胞中F-actin的含量降低；　　 (6)用Rho活性抑制剂C3转移酶和SRF活性抑制剂LatB处理FMNL2-CT过表达细胞后,细胞内SRF转录活性均显著降低(分别F=2774.936,P=0.000;F=4961.844,P=0.000和F=175.110,P=0.000；F=11041.858,P=0.000)；但经C3处理的FMNL2-CT过表达细胞其SRF转录活性仍高于经C3处理的Mock细胞(F=624.876,P=0.000和F=1185.209,P=0.000)；而经LatB处理的FMNL2-CT过表达细胞和Mock细胞相比,其SRF的转录活性无显著差异(F=0.249,P=0.624和F=0.109,P=0.746)。以上结果说明LatB能完全阻断活性FMNL2所引起的SRF转录激活,而C3转移酶只能部分阻断其转录激活,提示RhoA只能部分活化FMNL2,除了RhoA外还可能有其它分子参与FMNL2的活化；　　 (7)应用C3转移酶和Y27632处理FMNL2-CT过表达细胞后,细胞的体外侵袭能力显著降低(分别F=6.081,P=0.039；F=12.554,P=0.008和F=20.443,P=0.000；F=94.389,P=0.000),但C3转移酶处理组与Y27632处理组相比,其体外侵袭能力无显著差异(分别P=0.548,P=0.331)。　　 3 FMNL2及其相互作用蛋白在RhoA/Rock通路活化中的作用机制　　 (1)Rho pull-down实验和Western blot检测结果显示,在LPA刺激下,SW620/scrambled细胞中RhoA活性增强,P-MLC、P-LIMK、P-Cofilin的表达升高;而SW620干扰细胞中RhoA活性、P-MLC、P-LIMK和P-Cofilin的表达均无明显差异；　　 (2)双荧光素酶报告系统和鬼笔环肽荧光标记结果显示,在LPA刺激下,SW620/scrambled细胞中SRF转录活性增强(P=0.000),F-actin的含量增加；而SW620两个干扰细胞株中SRF转录活性(分别P=0.161,P=0.130)和F-actin的含量无明显变化；　　 (3)体外侵袭实验显示,在LPA刺激下,SW620/scrambled细胞的体外侵袭能力显著增强(P=0.001),而SW620两个干扰细胞株的体外侵袭能力无明显变化(分别P=0.546,P=0.700)；　　 (4)免疫共定位结果显示,FMNL2均能与LARG、p115RhoGEF共定位于细胞浆,FMNL2-CT过表达可能使LARG、p115RhoGEF持续活化,使其转位到胞膜。免疫共沉淀结果显示,FMNL2仅与LARG存在直接相互作用；　　 (5)获得瞬时干扰LARG的SW620和HT29/FMNL2-CT细胞株,Western blot结果显示两种细胞株中LARG蛋白的表达明显下降；　　 (6)LARG干扰后,两种细胞中RhoA—GTP活性,P-LIMK和P-MLC表达下降；两种细胞的体外侵袭能力均显著下降(分别P=0.000和P=0.000)。　　 结论：　　 1.FMNL2显著促进结直肠癌细胞的增殖、侵袭和转移能力；　　 2.FMNL2通过Rho细胞运动信号通路促进结直肠癌细胞的运动、侵袭；　　 3.FMNL2一方面可能在RhoA下游发挥作用,提高MAL/SRF的转录活性,增强肌动蛋白丝的聚合能力；另一方面还通过与LARG相互作用,在上游活化RhoA促进RhoA/ROCK信号通路激活,从而与RhoA之间组成了一条正反馈通路,增强信号调控的细胞效应,促进肿瘤细胞的运动及侵袭。　　 本研究的创新之处：　　 1.首次阐明FMNL2在肿瘤侵袭和转移中的作用,获得对这个功能未知基因的新认识；　　 2.提出并验证FMNL2参与Rho细胞运动信号通路的新机制。