【摘 要】
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在真核细胞中,80%-90%的蛋白质是被蛋白酶体所降解。蛋白酶体通过降解突变、错误折叠或其他蛋白质,调控细胞周期、细胞死亡和免疫反应等重要生理过程。REGγ,作为蛋白酶体调节颗粒,与20S核心颗粒构成一种非泛素和非ATP依赖的蛋白酶体降解体系。在此之前,关于REGγ-20S蛋白酶体的研究主要集中在其介导降解的底物蛋白及相关生理学功能,REGγ与底物蛋白识别机制的系统性研究尚未见报道,本研究拟从生物
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在真核细胞中,80%-90%的蛋白质是被蛋白酶体所降解。蛋白酶体通过降解突变、错误折叠或其他蛋白质,调控细胞周期、细胞死亡和免疫反应等重要生理过程。REGγ,作为蛋白酶体调节颗粒,与20S核心颗粒构成一种非泛素和非ATP依赖的蛋白酶体降解体系。在此之前,关于REGγ-20S蛋白酶体的研究主要集中在其介导降解的底物蛋白及相关生理学功能,REGγ与底物蛋白识别机制的系统性研究尚未见报道,本研究拟从生物化学及蛋白结构两个层面对REGγ与底物蛋白的识别机制进行解释。在本研究中,首先利用原核E.coli表达系统和真核Sf9昆虫细胞表达系统成功纯化得到REGγ蛋白。本课题组前期已掌握REGγ在原核E.coli的表达纯化方法,而将其“升级”至真核Sf9昆虫细胞层面,是传承也是创新。接下来,应用原核、真核表达纯化方法纯化底物蛋白HCV-core（HCV核心蛋白）、p21。然而蛋白大多出现在“包涵体”中,难以获得高质量蛋白,因此将目光聚焦至HCVcore和p21中与REGγ蛋白结合的关键部分。随后通过REGγ与Biotin-p21（140-164）多肽的体外结合、Avidin pull-down、生物膜干涉等实验验证多肽与REGγ结合的关键位点为R/K重复区域。进一步通过负染、冷冻电镜等技术初步得到REGγ-底物蛋白复合物的电镜结构,从分子结构层面初步解释了REGγ与底物蛋白的识别机制。总之,本研究从生物化学及分子结构层面对REGγ与底物蛋白的识别、结合机制进行了初步探索,既是对本实验室REGγ降解子理论的反向验证,也为全面理解REGγ的生理、病理学功能提供理论基础。
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