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肠球菌是家蚕消化道中的一种正常菌群。它直接参与了宿主的多种生理代谢活动,是宿主正常生理活动不可缺少的重要组成部分。同时肠球菌也是一种潜在性致病菌,健康家蚕对其具有足够的预防能力,只有在宿主体质虚弱或环境不良的情况下才会发挥致病作用,是引起家蚕细菌性肠道病的病原细菌,因此探讨该菌丛的生物学特性及生态变化,对了解家蚕细菌性肠道病致病机理和肠球菌与其它病原微生物互作等方面都具有重要意义。传统的数值分类学的鉴定方法,工作量大、时间长。随机扩增DNA多态性分析(RAPD)技术是分子生物学中重要的研究手段之一。它能在DNA水平反映不同样本之间的差别。本试验通过优化Mg2+浓度、DNA模板加入量、引物浓度、Taq DNA聚合酶加入量、PCR反应循环次数等建立了家蚕来源肠球菌的RAPD-PCR反应体系,并对从家蚕消化道中分离的表现为生理生化特性多样性的14个肠球菌分离菌株和3个标准菌株进行了DNA多态性研究。确定了家蚕来源肠球菌RAPD分析的反应体系:扩增反应总体积25μL,反应液中含模板DNA为50 ng;Mg2+ 3.5 mmol/L;dNTPs 200 mmol/L;Taq DNA聚合酶3 U;引物浓度15 pmol/L;PCR扩增程序为:94℃预变性3 min,94℃变性40 s,35℃退火40 s,72℃延伸1 min,45次循环,最后一个循环72℃延伸10 min,然后4℃保存。应用筛选的8条随机引物,共扩增出625个位点,其中99.7 %为多态性位点,表明供试菌株具有丰富的DNA多态性。对扩增结果进行聚类分析,供试菌株分为Ent.faecium、Ent.casseliflavus、Ent.avium、Ent.faecalis 4个类群。本试验RAPD分型结果与前期数值鉴定结果基本一致。本研究室前期研究结果表明,家蚕来源肠球菌外分泌蛋白具有抑制N.b发芽的作用。本试验以家蚕来源肠球菌(Ent.faecalis ZJU)和家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,简称N.b)为材料,筛选了一种适合E.f.ZJU生长和外分泌蛋白含量高的培养基,并对抑制微孢子虫发芽的菌外分泌蛋白进行了初步的分离纯化,以期为利用肠球菌开展蚕病的微生态防治提供参考。培养基的筛选试验表明,进口MRS(-G)培养基所得透析液的底色较浅,对用分光光度法测定微孢子虫的发芽抑制率影响最小。吐温添加量控制