肝脏是动物营养物质和能量代谢的重要场所,负责糖原合成、糖异生、脂肪酸与胆固醇的合成以及脂蛋白的生成和分泌等,并能对营养状态和激素信号作出响应,调节机体内的物质与能量平衡,尤其在糖脂类代谢方面发挥着重要的作用。当机体摄入过多的能量物质时,肝脏能将这些过量的能量物质转化为脂肪,并转运到脂肪组织贮存起来。长期摄入过多的能量最终会导致肥胖、脂肪肝和其他肥胖相关的代谢性疾病。在家禽生产中,脂肪沉积过多不仅影响动物的健康,还会引起饲料利用率和产蛋率下降等问题。沉积的脂肪除来自饲料中的少量脂肪外,主要来自肝脏重新合成的脂肪。因此,研究肝脏的脂肪代谢及其调控机制对于控制家禽的脂肪沉积极为重要。SIRT1是一种依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的去乙酰化酶,通过去乙酰化调节组蛋白和非组蛋白的活性,从而影响基因的表达,在众多的生物学过程中扮演重要角色。相对于哺乳动物,禽类肝脏中的糖脂代谢存在一些独特性。SIRT1在家禽肝脏中对糖脂代谢的调节作用及相关机制至今尚不十分清楚。本研究以广西三黄鸡为研究对象,探究营养状态对鸡肝脏中Sirt1及其他代谢相关基因表达的影响;分析Sirt1的表达变化对鸡原代肝细胞中脂代谢的影响;高糖、高脂对Sirt1基因表达和肝脏细胞代谢的影响以及Sirt1基因在肝脏内转录调控机制等方面进行研究,希望通过以上工作,揭示Sirt1基因在鸡肝脏糖脂代谢特别是脂类代谢中的重要作用和机制,从而为控制肉鸡体脂过多沉积提供有用的信息。主要研究方法和结果如下:(1)鸡Sirt1基因的时空表达规律利用荧光定量对4周龄鸡不同组织和鸡不同生长期肝脏中Sirt1基因的mRNA表达水平进行检测,以揭示Sirt1基因的时空表达规律。结果显示,Srt1基因在大多数的组织中表达,在肾脏中的表达相对较高,而不同生长期的肝脏中Sirt1的表达水平基本不变。(2)饥饿对鸡肝脏中Sirt1和相关基因表达的影响本研究通过饥饿试验阐述营养状况对鸡肝脏中Srt1基因和相关基因表达的影响,数据显示,相对于非禁食的正常饲喂组,鸡在禁食24h后的血糖有一定程度的下降(p<0.01),而血脂的浓度则显著地降低(p<0.01),胆固醇无明显变化。禁食组肝内Sirt1的mRNA较对照组表达量增加1.27倍(p<0.01),蛋白水平也明显增加;Pgc-1a、Ppara、Foxo1、Hnf1a、Vnn1、Mt3、和Atgl等基因的mRNA相对表达水平分别增加了 7倍(p<0.01),1.46倍(p<0.01)、0.5 倍(p<0.01)、0.36 倍(p<0.01)、0.5 倍(p<0.01)、25.8 倍(p<0.01)和 2.26倍(p<0.01),而Fasn基因则下降至对照组(正常饲喂组)的1/13左右(p<0.01);与禁食组相比,短时间(2 h)重喂饲导致血糖略有上升(p<0.01),血脂则明显上升(p<0.01),但仍低于正常喂饲组,而肝中Sirt1基因的mRNA水平则迅速减少(p<0.01),甚至低于正常喂饲组,Pgc-1a、Ppara、Foxo1、Hnfla、Vnn1、Mf3、和Atgl等基因的 mRNA 水平也迅速降至正常喂饲组的水平,Fasn回升至对照组的1/4(p<0.01)。以上结果说明肝脏中Sirt1基因和其他与能量代谢、脂肪代谢相关的基因能够对鸡的营养状态作出迅速而有效的响应,这些基因可能在能量和脂肪代谢中发挥重要作用。(3)鸡肝脏中受Sirt1调控的基因和信号通路为进一步阐述鸡肝脏中Sirt1基因在能量和物质代谢中的作用,本研究利用siRNA干扰鸡原代肝脏细胞中Sirt1基因的表达,并通过RNA-seq分析Sirt1基因表达减少后对细胞转录组的影响。结果显示,Sirt1表达减少导致86个基因产生差异性表达,其中63个基因表达减少,23个基因表达增加。GO分析显示,70个差异表达基因与生物过程有关,58个差异表达基因与细胞组成相关,77个差异表达基因与分子功能相关。KEGG通路分析结果显示,差异表达基因分别涉及代谢、遗传复制表达、细胞功能、外界信号转导和疾病等通路,其中Adh6、H6pd、Hexa_b和Glms与碳水化合物代谢有关,Adh6、Acsl4、Lipa、Gnpat与脂类代谢有关。此外,Vnn1、Mt3(表达减少)和Frzb(表达增加)的表达受到Sirt1干扰的影响,这3个基因分别与肝脏的糖脂类代谢和肝细胞的发育有关。在随后的LMH细胞中Sirt1的瞬时过表达试验也部分证实了 Sirt1基因对Lipa、Frzb、Adh6、Acsl4、Vnn1和Mt3的表达调控。这些结果说明Sirt1基因通过调控多个信号通路影响肝脏的代谢和功能。(4)Sirt1基因低表达LMH细胞系的建立为进一步阐述Sirt1基因在鸡肝脏应答糖脂代谢时的作用,本研究依据鸡Sirt1基因的3UTR序列设计针对不同位点的3个miRNAs,构建了能稳定过表达miRNA且干扰效果好的LMH细胞系,该细胞系中Sirt1基因的低表达持续且稳定。数据表明,3个的miRNAs均能高效地抑制含有对应靶位点Sirt1基因3’UTR序列报告载体荧光素酶的活性,在LMH细胞瞬时过表达这3个miRNAs 48 h后,Sirt1的mRNA水平分别被抑制了 30%左右,说明这3个miRNAs能从mRNA水平干扰Sirt1基因的表达。以gSmiR30包装的病毒颗粒成功感染了 LMH细胞,通过G418抗性筛选,细胞内的GFP表达率达99%以上,Sirt1基因mRNA水平的抑制率达到75%左右,蛋白质表达水平也明显下降,这些数据表明Sirt1基因稳定低表达的细胞系已成功构建,该细胞系被命名为LMH-gSmiR30细胞系。(5)高糖、高脂通过Sirt1调控糖脂代谢关键基因的表达为探究Sir1基因在肝细胞糖脂应答反应中的作用,本研究用高糖、高脂处理构建的LMH-gSmiR30细胞和LMH-pmirG(对照组细胞),并检测细胞中脂滴积累情况及相关基因的表达量。结果显示,在LMH-gSmiR30细胞中Sirt1的mRNA表达水平不随葡萄糖的浓度增加而变化,Sirt1基因的低表达改变了H6pd、G6pc和Vnn1基因在LMH细胞中的表达,影响了 LMH细胞对葡萄糖应答反应。在LMH-pmirG和LMH-gSmiR30细胞中,高糖高脂抑制了Sirt1、H6pd、Fasn、Ppara基因的mRNA水平,但两种细胞之间的变化差异不明显,而G6pc、Atgl在LMH-gSmiR30细胞中的表达要明显低于LMH-pmirG中的表达,说明Sirt1基因表达的低表达降低了 LMH细胞中G6pc、Agl对高糖高脂的应答,抑制了糖酵解和脂肪的降解,促使细胞内的脂肪滴的形成,这一推测得到了油红染色结果的验证。(6)鸡Sirt1基因的启动子结构与功能研究为分析鸡Sirt1基因在肝脏内转录水平的调控机制,本研究通过5’RACE技术扩增获得14 bp长的5’UTR序列,通过生物信息学分析预测该基因的启动子结构和功能片段,并利用序列删除技术证实了影响转录活性的关键区域位于起始密码子上游106-129 bp之间,可能是TATA box元件所在区域,研究还发现,129～165 bp之间存在对Sirt1基因转录具有促进作用的元件。(7)甲基化对鸡肝细胞中Sirt1基因表达的影响为研究甲基化对鸡肝细胞中Sirt1基因表达的影响,本研究利用Methyl Primer Express V1.0预测到Sirt1基因的第一个外显子和5’UTR及其上游序列中存在一个约1600 bp长的“CpG”岛(包含Sirt1基因的第一个外显子和上游1200bp左右的序列)。LMH细胞经5-氮杂胞嘧啶核苷处理6天后,检测发现Sirt1基因mRNA水平在LMH细胞中得到了显著提高,1.0μmol/L的5-AZA处理后提高60%以上(p<0.01),这些说明甲基化抑制了鸡Sit1基因在肝脏细胞中的表达。(8)鸡肝细胞中miRNAs对Srt1基因表达的调控为探讨miRNAs对鸡肝细胞中Sirt1基因表达的调控,本研究通过3’RACE技术扩增获得Sirt1基因1710 bp长的3’UTR序列,利用miRanda和TargetScan软件进行分析,发现136个miRNAs对Sirt1的表达具有潜在的调节作用。根据miRNA和靶位点作用的评分高低和自由能高低,挑选了 12个miRNAs评分较好的miRNAs进一步验证。结果显示,gga-miR-204和gga-miR-302b-3p能有效地抑制含靶位点的荧光素酶活性,而靶位点突变会使抑制效果消失,说明Srt1可能是gga-miR-204和gga-miR-302b-3p的靶基因。由于在肝脏中并未检测到gga-miR-302b-3p的表达,本研究在LMH细胞和鸡原代肝细胞中进一步验证了gga-miR-204对Sirt1基因表达的影响。数据显示,gga-miR-204抑制了 LMH细胞和鸡原代肝细胞中Sirt1基因mRNA的表达水平以及LMH细胞中SIRT1蛋白表达水平,这证实了在肝细胞中Sirt1基因的表达受gga-miR-204调控。