论文部分内容阅读
野樱莓（Aronia melanocarpa,Aronia mitschurinii）富含多酚类生物活性物质,而关于其生理活性的研究较少。目前,野樱莓多酚的生物活性研究及其工业利用以有机溶液浸提为主,为游离态的多酚（Extractable polyphenols,EPPs）,忽略了野樱莓中以结合态形式存在的多酚（Non-extractable polyphenols,NEPPs）,从而鲜少有关于NEPPs的代谢产物及其生物活性方面的研究。因此,本课题对野樱莓中游离态多酚EPPs、结合态多酚NEPPs的组成及成分进行全面分析,并利用体内、体外多种模型对野樱莓多酚的生理活性及其相关作用机理展开研究。（1）采用丙酮/水/乙酸（70：29.5：0.5,v/v/v）体系提取野樱莓游离态多酚EPPs后,进一步利用固相萃取、柱层析（sephadex LH-20）对其中花色素苷、黄酮、原花青素进行分离纯化。此外,采用酸水解技术对野樱莓中的结合态多酚NEPPs进行水解和提取。利用UHPLC分析EPPs和NEPPs中各成分及含量,EPPs中含量最高的为矢车菊素糖苷,3-半乳糖苷为32176±815 nmol/g,3-阿拉伯糖苷为9515±174 nmol/g;原花青素主要以多聚体（聚合度大于12）为主12302±2889 nmol/g。NEPPs中大部分为矢车菊素69104±6553 nmol/g,其余为矢车菊素-3-O-半乳糖苷2391±212 nmol/g,槲皮素1992±145 nmol/g。经对比,冻干野樱莓粉中游离态多酚EPPs占总多酚58.86%,含量为30947.85±993μg/g DW;NEPPs占41.14%,其含量为21631±694μg/g DW。（2）基于EPPs和NEPPs与肠道菌群间相互作用不同的假设,探讨野樱莓及其不同形式多酚（EPPs,NEPPs）对肠道菌群及其代谢物（短链脂肪酸、多酚经肠道菌群降解的产物）的影响。以健康C57BL/6J小鼠为模型,分别给予冻干野樱莓粉（AB,同时含游离态EPPs和结合态多酚NEPPs）、野樱莓乙醇提取物（AE,游离态多酚EPPs）、野樱莓提取果渣（D,结合态多酚NEPPs）的饮食干预一周。AB和D组中肠道内容物矢车菊素及原儿茶酸含量显著高于AE组,邻苯二酚代谢通路（Catechol degradation I pathway,PWY-5415）显著高于只含EPPs的AE组,说明AB和D中的NEPPs可被肠道菌群游离化并代谢利用。该代谢通路的上调是由于AB和D组显著富集的物种Lachnospiraceae（科）。此外,各组的特征差异菌群与其上调的肠道短链脂肪酸产量正相关,AB组菌群通过琥珀酸和丙酮酸代谢通路产生丁酸;AE组主要通过赖氨酸合成丁酸;D组主要通过乙酰辅酶A（acetyl-Co A）代谢丙酮酸产生乙酸。（3）基于野樱莓及其多酚（EPPs,NEPPs）与肠道菌群之间相互作用的不同,进一步展开其对肠道屏障功能的不同影响。采用分化的Caco-2细胞建立的上皮屏障模型,研究野樱莓及其多酚（EPPs,NEPPs）、单一活性多酚及其代谢物对促炎因子IC（inflammatory cocktail）诱导的肠道屏障功能的影响及其作用机制。野樱莓及其多酚显著提高了受损肠道屏障的完整性（跨膜电阻TEER%的提高）和紧密性（荧光染料LY转运量的降低）,对受损的肠道屏障具有保护作用。这种保护作用的机制是紧密连接（tight junction,TJ）ZO-1、OCLN和CLDN1的m RNA和蛋白水平表达量的显著上调;NEPPs与EPPs对屏障保护的程度有所不同,与含EPPs的提取物相比,提取果渣（含NEPPs）处理后的上皮屏障紧密性更高;紧密连接ZO-1显著增加,m RNA和蛋白水平的表达量分别提高了20.1%和32.8%。野樱莓中的活性多酚矢车菊素-3-半乳糖苷（C3gal）、槲皮素（Q）及其代谢产物3,4-二羟基苯乙酸（DOPAC）均能显著改善受损上皮屏障的完整性和紧密性,显著上调ZO-1、OCLN和CLDN1的表达量;槲皮素的保护效果最高:较损伤对照IC组相比,TEER值提高了69.4%,LY的透过量减少了52.3%,紧密连接（TJ）的m RNA和蛋白表达量增加～182.6%。（4）大量的体内实验表明野樱莓的摄入与抑制炎症相关,因此探讨野樱莓生物活性多酚及其代谢物对T细胞介导的免疫应答的调节功能及其机制。免疫磁珠分选从小鼠脾细胞中分离得到初始CD4+T细胞（CD4+CD25-）,建立并优化了体外调节性T细胞极化模型,荧光耦合抗体标记细胞后采用流式细胞术进行分析。2μM槲皮素增加了分化的调节性T细胞Treg（CD4+CD25+）数量,与不加处理的对照组相比上调了22.3%。此外,Treg亚群分泌抗炎因子IL-10+的Treg细胞以及Foxp3+IL-10+Treg细胞数量均显著增加,分别是不加处理的对照组的21倍,34倍。槲皮素代谢物3,4-二羟基苯乙酸（DOPAC）对极化的Treg细胞及其亚群的数量呈相同的增殖作用。初步证明了野樱莓中的活性物质通过促进分化调节性T细胞及其抗炎因子IL-10,从而抑制过度的免疫反应。（5）以SARS-Cov-2冠状病毒S蛋白与宿主细胞结合的受体ACE2为靶点,考察野樱莓多酚中活性成分的抗病毒能力。待测的10μM黄酮类化合物（B环3’,4’-羟基）对rh ACE2的抑制率范围为15～66%。其中芦丁、槲皮素-葡萄糖苷、tamarixetin和3,4-二羟基苯乙酸DOPAC对rh ACE2的抑制率达42～48%,槲皮素是被测物中最有效的rh ACE2抑制剂,半数有效抑制浓度IC50为4.48μM。其抑制机理为破坏rh ACE2酶和底物的亲和力（Km升高）、降低最大反应速度Vmax、降低酶催化效率Kcat/Km。结果表明,槲皮素及其代谢物对rh ACE2有抑制活性,并构建了黄酮类化合物（B环3’,4’-羟基）与抗病毒功能之间的构效关系。综合以上体内、体外的研究结果,证明了野樱莓多酚对肠道健康、免疫调节以及病毒抑制方面的功能活性,为全面开发野樱莓功能性食品提供理论基础。