继发性胰腺感染(SPI)是重症急性胰腺炎(SAP)患者发病2～3周后，在胰腺周围发生的局部感染性并发症，是SAP患者在病程中、后期死亡的主要原因。SPI的实质是肠道细菌和内毒素移位入血所致的肠源性感染，因此，肠源性感染是否得到控制将直接影响SAP患者的预后。实际上，许多疾病的发生、发展和预后均与肠源性感染密切相关，但是SPI的特殊性在于发生感染后难以进行有效的手术引流、常常需要多次手术和多次置管引流，而且全身性败血症和局部感染交替出现，成为恶性循环。采用手术引流、广谱抗生素、选择性消化道清洁(SDD)、肠道营养支持和肠粘膜保护剂等治疗方法均难以降低SPI的死亡率。其中广谱抗生素尽管可以控制全身性败血症，SDD也可以减少肠道细菌数量和内毒素含量，但它们均会导致肠道耐药菌过度滋生和优势定植，使病情更为复杂化。一旦耐药菌移位至胰腺周围坏死组织后，抗生素难以通过血胰屏障而达到有效治疗浓度。此外，多次手术引流也使患者遭受了巨大痛苦，住院时间延长、住院费用增加。因此，急需寻找新的防治对策以弥补现有治疗方法的不足。近年研究发现的肠道天然免疫物质防御素5(HD-5)因具有广谱杀菌抑菌作用，又来源于肠粘膜本身，耐受消化道的多酶环境，可能具有广泛的应用前景，从而促使我们将HD-5体外重组和SPI的防治联系起来，以期望能在SAP早期运用重组HD-5来防止SPI的发生。 为了阐明SPI的有关特征，我们对1980～1999年间收治的60例SAP患者进行了病例回顾。结果发现，SPI患者的平均住院天数、平均住院费用、病死率、发热天数、院外滞留时间、白细胞升高持续时间均明显高于非SPI患者。此外，从发病到通便的时间间隔明显延长，无通便病例均死亡。在三种SPI类型中，感染性胰腺坏死病死率最高，胰腺脓肿次之(假性 中文摘要 胰腺囊肿伴感染仅1例）；此外，SPI的发生和胰腺的受损害程度并无直接 关系。SPI病原菌主要为肠杆菌科和假单胞菌属，以混合感染为主。上述 结果表明，SPI的实质是肠源性感染，且严重影响了SAP患者的预后，现 有的治疗措施难以有效阻止肠源性感染的发生，需要寻找新型防治策略。 针对上述问题，结合HD－5相关研究结果，设计了四个实验，以探讨 通过构建人防御素5重组表达质粒、转染哺乳动物细胞CHO－KI、获得 rHD－5的可能性，并通过杀菌试验和抗粘附试验来了解rHD－5的抗菌／抑菌 作用。结果表明，回肠粘膜中存在HD－5 InRNA的转录，从空肠起始部到 回肠末端的粘膜均有HD－5 InRNA的表达，并有逐渐增加的趋势，与肠道 细菌的分布规律相一致。所获得的目的片段HD6 CDNA大小为 282hp，与 理论值一致，且不同个体间的编码序列是完全一致的。通过基因重组技术，？将HD6山NA）顺利插入真核表达质粒pCDNA3．少冲，获得了重组质粒 pCDNA3．1（＋）－HD6。DNA。随后将其转染入 CHO－KI细胞中，通过RT．PCR 方法检测到了 HD－5 mANA的表达，通过SDS－PAGE技术发现表达产物 rHD乃是小于 8～14 kDa的粗肽，结合该产物对 JMloo和 JM；0－pcDNA3．1什） 的杀菌活性表明，目的基因HD－5 CDNA得到了有效表达。体外杀菌／抑菌 试验发现，随着rHD6浓度的逐渐增加源液6倍浓缩液4 倍浓缩液），大刁 肠杆菌标准株、金黄色葡萄球菌标准株和表皮葡萄球菌野生株的抑菌环直 径呈剂量依赖性增大。绿脓杆菌标准株和鲍曼氏不动杆菌野生株仅10倍浓 缩液具有杀菌作用，但三种浓度的rHD－5对绿脓杆菌野生菌株均无杀菌效 果。通过抗粘附试验发现，不同浓度的rHD－5干预绿脓杆菌野生株后，其 粘附力有不同程度的降低，呈剂量依赖趋势；被绿脓杆菌野生株攻击的 IEC－6细胞受损程度随rHD－5浓度的增加而逐渐减轻。 。本研究可以得出以下结论：＊诣PI的发生增加了SAP患者的死亡风险， 延长了住院时间，从而严重影响了SAP患者的预后。o尸PI的混合感染高 于单一感染，其致病菌主要为肠道条件致病菌，其中绿脓杆菌感染的发生 仅次于大肠杆菌，应引起重视。O）空、回肠粘膜均有HD6 mRNA表达， 且沿小肠长轴有逐渐增加的趋势。K）通过RTFCR方法获得了编码HD6 Vll d 中文摘要的目的基因片段 HD6 CDNA，并成功插入到真核表达质粒pCDNA3．let）中，构建了重组质粒pCDNA3．l（叶一HD巧 CDNA。O）采用脂质体介导转染方法，成功将重组质粒转染到CHO－KI细胞中：并从1llJ：uYA和蛋白水平初步证实了HD6 on－MA的表达。的）表达的重组蛋白tID6具有