1研究背景及目的戊己丸是临床上治疗肠易激综合征(Irritable bowel syndrome, IBS)的有效方剂,由黄连、制吴茱萸和土炒白芍组成,其中黄连为君药,制吴茱萸和土炒白芍为臣药。本课题组前期的戊己丸的药代动力学(Pharmacokinetic, PK)研究是在正常动物体内进行的,而未研究其在病理状态下的PK。鉴于药物主要是作用于病理状态的机体,故研究病理状态下的PK更有意义。此外,IBS是一种肠道功能紊乱但胃肠道结构无明显异常的疾病,而且肠道的IBS病理状态对于药物吸收的影响还不得而知。因此本课题旨在利用炎症后IBS (PI-IBS)和慢性内脏高敏感IBS (CVH-IBS)大鼠模型,采用UPLC-MS/MS的技术,比较盐酸小檗碱标准品(小檗碱)、黄连(小檗碱和巴马汀)、戊己丸(小檗碱、巴马汀、吴茱萸碱、吴茱萸次碱和芍药苷)单次给药后,代表成分在正常大鼠和以上两种IBS模型大鼠体内的PK差异。在此基础上,又比较了戊己丸单次以及多次给药后,5个代表成分在正常大鼠和两种IBS模型大鼠体内的PK差异,并应用免疫组化和免疫荧光技术,从大鼠结肠中的紧密连接蛋白(Occludin和ZO-1)、肌球蛋白轻链激酶(MLCK)以及转运蛋白(P-gp、MRP1和MRP2)的角度探讨戊己丸代表成分PK差异的原因。2研究方法和内容2.1UPLC-MS/MS法同时测定血浆中戊己丸五个代表成分含量的方法学研究采用蛋白沉淀法对血浆进行样品前处理,建立同时测定血浆中戊己丸中的5个代表成分含量的UPLC-MS/MS方法。2.2盐酸小檗碱、黄连和戊己丸分别给药后,各代表成分在正常大鼠和PI-IBS模型大鼠体内的药代动力学比较首先采用乙酸联合束缚应激的方法建立PI-IBS大鼠模型,以大鼠的结肠运动、2h的排便粪粒数、玻璃小球排出时间为观测指标,同时通过HE染色和甲苯胺蓝染色观察大鼠结肠的病理变化以及肥大细胞的数量变化对所建立的PI-IBS大鼠模型进行评价。待模型成功后,分别给正常大鼠及模型大鼠行颈静脉插管手术,术后12h,通过插管采血0.2mL于肝素化的EP管中,同时通过插管补充0.2mL的肝素钠溶液(50IU/mL)。然后,分别灌胃给予盐酸小檗碱(25mg/kg,相当于小檗碱22mg/kg)、黄连提取物(96mg/kg,分别相当于小檗碱22mg/kg和巴马汀5.3mg/kg)、戊己丸(157.4mg/kg,分别相当于小檗碱22mg/kg、巴马汀5.3mg/kg、吴茱萸碱0.055mg/kg、吴茱萸次碱0.07mg/kg和芍药苷6.265mg/kg),并于给药后5min、15min、30min、1h、3h、4h、6h、8h、10h、12h、24h、36h通过插管采I血0.2mL于肝素化的EP管中,同时通过插管补充0.2mL的肝素钠溶液(50IU/mL)。离心,取血浆100μL,冻存于-80℃。然后采用UPLC-MS/MS技术测定代表成分的含量。绘制药时曲线,并利用WinNonlin软件计算药代参数(T1/2、Tmax、Cmax、AUC0-t、Vd/F和C1/F),比较各代表成分在正常大鼠和PI-IBS模型大鼠体内的PK差异。2.3盐酸小檗碱、黄连和戊己丸分别给药后,各代表成分在正常大鼠和CVH-IBS模型大鼠体内的药代动力学比较首先采用乳鼠结肠PTCA球囊刺激的方法建立CVH-IBS大鼠模型,以大鼠的每周体重变化、腹部抬起和弓背抬高阈值为观测指标,通过HE染色和甲苯胺蓝染色观察大鼠结肠的病理变化及肥大细胞的数量变化,而且应用免疫组化技术分析结肠中的原癌基因c-fos表达的变化对所建立的CVH-IBS大鼠模型进行评价。待模型成功后,同2.2方法给药、取血浆、测定代表成分含量,绘制药时曲线,并利用WinNonlin软件计算药代参数(T1/2、Tmax、Cmax、AUC0-T、Vd/F和C1/F),比较各代表成分在正常大鼠和CVH-IBS模型大鼠体内的PK差异。2.4戊己丸单次给药及多次给药后,5个代表成分在正常大鼠和PI-IBS模型大鼠体内的药代动力学比较及其机制研究按“2.2”方法建立PI-IBS大鼠模型。待模型成功后,分别用于戊己丸高剂量单次给药及多次给药的药代动力学研究。单次给药时,给大鼠灌胃戊己丸(629.6mg/kg,分别相当于小檗碱88mg/kg、巴马汀21.1mg/kg、吴茱萸碱0.22mg/kg、吴茱萸次碱0.28mg/kg和芍药苷25.1mg/kg)；对于多次给药,连续给药6天,每天一次,给药量同单次给药,在第6天给药后12h,对各大鼠行颈静脉插管,术后12h后,给大鼠灌胃戊己丸(629.6mg/kg,分别相当于小檗碱88mg/kg、巴马汀21.1mg/kg、吴茱萸碱0.22mg/kg、吴茱萸次碱0.28mg/kg和芍药苷25.1mg/kg),并于给药后按“2.2”所示时间点取血浆,然后用“2.1”所建立的方法检测5个代表成分的含量。绘制药时曲线,并利用WinNonlin软件计算药代参数(T1/2、Tmax、Cmax、AUC0-t、Vd/F和CI/F),然后比较戊己丸高剂量单次给药及多次给药各代表成分的药代参数在正常组和模型组的差异。36h的采血点完毕后,处死大鼠,迅速取两段结肠,一段固定到2.5%的戊二醛溶液中,另一段固定到4%的多聚甲醛中,石蜡包埋切片。首先采用透射电镜观察大鼠结肠上皮紧密连接的超微结构,然后采用免疫组化和免疫荧光技术检测大鼠结肠中的紧密连接蛋白(Occludin和ZO-1)、肌球蛋白轻链激酶(MLCK)和转运蛋白(P-gp、MRP1和MRP2)的表达,探讨戊己丸中的5个代表成分在正常大鼠和PI-IBS模型大鼠体内的PK差异的机制。2.5戊己丸单次给药及多次给药在正常大鼠和CVH-IBS模型大鼠体内的药代动力学比较及其机制研究按“2.3”方法建立CVH-IBS大鼠模型。待模型成功后,分别按照“2.4”方法研究戊己丸高剂量单次给药及多次给药在正常大鼠和CVH-IBS模型大鼠体内的药代动力学差异及其机制研究。3研究结果3.1UPLC-MS/MS法同时测定血浆中戊己丸5个代表成分含量的方法学研究本文建立的UPLC-MS/MS法可同时测定血浆中的戊己丸5个代表成分的含量,方法专属性好,灵敏准确。3.2盐酸小檗碱、黄连和戊己丸分别给药后,各代表成分在正常大鼠和PI-IBS模型大鼠体内的药代动力学比较本实验采用乙酸联合束缚应激的方法建立的PI-IBS模型大鼠体重略微下降、结肠运动障碍、排便异常、肥大细胞数目显著增多,较好的模拟了临床上PI-IBS的症状,可以作为PI-IBS的动物模型用于科学研究。通过对盐酸小檗碱、黄连和戊己丸的代表成分在正常大鼠PI-IBS模型大鼠体内的药代动力学的研究发现,与正常组相比：(1)给予盐酸小檗碱后,小檗碱在PI-IBS大鼠体内的AUC0-t显著增加,Cl/F显著降低。(2)灌胃黄连提取物后,小檗碱在PI-IBS大鼠体内的Cmax和AUCo-t显著增加,Vd/F和Cl/F显著降低,而巴马汀在PI-IBS大鼠体内的AUC0-t显著增加,其他的药代参数未见显著差异。除此之外,在模型大鼠体内,小檗碱和巴马汀均出现了双峰。(3)给予戊己丸后,小檗碱在PI-IBS大鼠体内的Cmax和AUC0-t显著增加,Vd/F和C1/F显著降低；巴马汀在PI-IBS大鼠体内的AUCo-t显著增加,T1/2和Cl/F显著降低；芍药苷在PI-IBS大鼠体内的Cmax和AUCo-t显著增加,Vd/F和Cl/F显著降低。3.3盐酸小檗碱、黄连和戊己丸分别给药后,各代表成分在正常大鼠和CVH-IBS模型大鼠体内的药代动力学比较本实验采用乳鼠结肠PTCA球囊刺激的方法建立的CVH-IBS大鼠模型表现出了内脏痛觉超敏、肥大细胞显著增多,而且原癌基因c-fos的表达显著升高,进一步佐证了内脏超敏的原因。因此,该模型可以作为CVH-IBS的动物模型用于科学研究。通过对盐酸小檗碱、黄连提取物和戊己丸的代表成分在正常大鼠和CVH-IBS大鼠体内的药代动力学的研究发现,与正常组相比：(1)给予盐酸小檗碱后,小檗碱在CVH-IBS大鼠体内的T1/2和AUCo-t显著增加,Cl/F显著降低。(2)灌胃黄连提取物后,小檗碱在CVH-IBS大鼠体内的T1/2、Tmax和AUCo-t显著增加,Vd/F和C;/F显著降低,而巴马汀的药代参数未见显著差异。(3)给予戊己丸后,小檗碱在CVH-IBS大鼠体内的AUCo-t显著增加,T1/2、Cmax、Vd/F和C;/F显著降低；巴马汀在CVH-IBS大鼠体内的Cmax和AUCo-t显著增加,Tmax、Vd/F和Cl/F显著降低；吴茱萸碱在CVH-IBS大鼠体内的Cmax显著增加,Tmax、Vd/F和C1/F显著降低；吴茱萸次碱在CVH-IBS大鼠体内的Cmax和AUCo-t显著增加,Vd/F显著降低；芍药苷在CVH-IBS大鼠体内的Cmax和AUCo-t显著增加,Vd/F和Cl/F显著降低。3.4戊己丸单次给药及多次给药在正常大鼠和PI-IBS模型大鼠体内的药代动力学比较及其机制研究戊己丸高剂量单次给药及多次给药后其5个代表成分在正常大鼠和PI-IBS模型大鼠体内的药代动力学的研究发现,与正常组相比：(1)戊己丸高剂量单次给药后,小檗碱在PI-IBS大鼠体内的T1/2、Tmax、Cmax和AUCo-t显著增加,Cl/F显著降低；巴马汀在PI-IBS大鼠体内的AUCo-t显著增加,Vd/F和C1/F显著降低；吴茱萸碱在PI-IBS大鼠体内的Tmax、Cmax和AUC0-t显著增高,Cl/F显著降低；吴茱萸次碱在PI-IBS模型大鼠体内的AUC0-t显著增高,Vd/F和Cl/F显著降低；芍药苷在PI-IBS模型大鼠体内的Cmax和AUCo-t显著增高,Vd/F和C1/F显著降低。(2)戊己丸高剂量多次给药后,小檗碱在PI-IBS大鼠体内的Cmax和AUC0-t显著增加,TmaxVd/F和C1/F显著降低；巴马汀在PI-IBS大鼠体内的T1/2和AUC0-t显著增加,Tmax、Vd/F和C1/F显著降低；吴茱萸碱在PI-IBS大鼠体内的Cmax和AUC0-t显著增高,T1/2、Tmax、Vd/F和C1/F显著降低；吴茱萸次碱在PI-IBS模型大鼠体内的Cmax显著增高,Vd/F和C1/F显著降低；芍药苷在PI-IBS模型大鼠体内的T1/2、Cmax和AUC0-t显著增高,Cl/F显著降低。(3)透射电镜的结果表明：正常组大鼠结肠上皮紧密连接结构完整、连接致密；模型组大鼠结肠上皮紧密连接结构破坏,连接疏松、间隙增宽、密度降低；而戊己丸给药一周后,结肠上皮紧密连接结构较模型组恢复完整,连接恢复。(4)免疫组化的结果表明：对于紧密连接蛋白Occludin和ZO-1,与正常组相比,在PI-IBS模型组大鼠结肠中显著下降。多次给药后,它们在模型组的表达显著高于给药前的模型组,而在正常组的表达与给药前的正常组无明显差异。但是多次给药后的正常组和模型组相比,在模型组的表达低于正常组；对于MLCK,与正常组相比,在PI-IBS模型组大鼠结肠中显著升高。多次给药后,它们在模型组的表达显著低于给药前的模型组,而在正常组的表达与给药前的正常组无明显差异。但是多次给药后的正常组和模型组相比,在模型组的表达高于正常组；对于转运蛋白P-gp、MRP1和MRP2,与正常组相比,在PI-IBS模型组大鼠结肠中的表达未见明显变化。多次给药后,它们在模型组和正常组内的表达均显著高于给药前相应的正常组和模型组,但是多次给药后的正常组和模型组相比,它们的表达未见明显差异。(5)免疫荧光的结果表明：与正常组相比,模型组内的紧密连接表达下降,MLCK的表达升高。但是多次给药后,模型组大鼠结肠中紧密连接蛋白的表达显著高于给药前的模型组,而MLCK的表达显著低于给药前的模型组。多次给药后的正常组,紧密连接蛋白和MLCK的表达与给药前的正常组无明显差异。而多次给药后的正常组和模型组相比,紧密连接蛋白在模型组的表达低于正常组,MLCK的表达高于正常组。3.5戊己丸单次给药及多次给药在正常大鼠和CVH-IBS模型大鼠体内的药代动力学比较及其机制研究戊己丸高剂量单次给药及多次给药后其5个代表成分在正常大鼠和CVH-IBS大鼠体内的药代动力学的研究发现,与正常组相比：(1)戊己丸高剂量单次给药后,小檗碱和巴马汀在CVH-IBS大鼠体内的T1/2和AUC0-t显著增加,Cl/F显著降低；吴茱萸碱在CVH-IBS大鼠体内的Cmax和AUC0-t显著增高,T1/2、Tmax、Vd/F和Cl/F无显著性差异；吴茱萸次碱在CVH-IBS模型大鼠体内的各药代参数均无显著性差异；芍药苷在CVH-IBS模型大鼠体内的Tmax和AUCo-t显著增高,C1/F显著降低。(2)戊己丸高剂量多次给药后,小檗碱和巴马汀在CVH-IBS大鼠体内的T1/2、Vd/F和Cl/F显著增加,Cmax和AUCo-t显著降低；吴茱萸碱在CVH-IBS大鼠体内的Cmax和AUC0-t显著增高,T1/2、Tmax和Vd/F显著降低;吴茱萸次碱在CVH-IBS模型大鼠体内的Cmax显著增高,Tmax显著降低；芍药苷在CVH-IBS模型大鼠体内的Tmax显著增高,而T1/2、Cmax、AUC0-1、Vd/F和Cl/F无显著性差异。(3)透射电镜的结果表明：正常组大鼠结肠上皮紧密连接结构完整、连接致密；模型组大鼠结肠上皮紧密连接结构破坏,连接疏松、间隙增宽、密度降低；而戊己丸给药一周后,结肠上皮紧密连接结构较模型组恢复完整,连接恢复。(4)免疫组化的结果表明：对于紧密连接蛋白Occludin和ZO-1,与正常组相比,在CVH-IBS模型组大鼠结肠中显著下降。多次给药后,它们在模型组的表达显著高于给药前的模型组,而在正常组的表达与给药前的正常组无明显差异。但是多次给药后的正常组和模型组相比,在模型组的表达低于正常组；对于MLCK,与正常组相比,在CVH-IBS模型组大鼠结肠中显著升高。多次给药后,它们在模型组的表达显著低于给药前的模型组,而在正常组的表达与给药前的正常组无明显差异。但是多次给药后的正常组和模型组相比,在模型组的表达高于正常组；对于转运蛋白P-gp、MRP1和MRP2,与正常组相比,在CVH-IBS模型组大鼠结肠中的表达未见明显变化。多次给药后,它们在模型组和正常组内的表达均显著高于给药前相应的正常组和模型组。但是多次给药后的正常组和模型组相比,它们在模型组的表达显著高于正常组。(5)免疫荧光的结果表明：与正常组相比,模型组内的紧密连接表达下降,MLCK的表达升高。但是多次给药后的模型组,紧密连接蛋白的表达显著高于给药前的模型组,而MLCK的表达显著低于给药前的模型组。多次给药后的正常组,紧密连接蛋白和MLCK的表达与给药前的正常组无明显差异。而多次给药后的正常组和模型组相比,紧密连接蛋白在模型组的表达低于正常组,MLCK的表达高于正常组。4结论戊己丸单次给药及多次给药后在正常动物和肠易激综合征的病理状态下的药代动力学行为存在明显差异,其差异的机制可能与转运蛋白和紧密连接蛋白有关,该研究结果提示戊己丸在用于治疗肠易激综合征时,要根据机体的不同状态及用药时程,对其剂量进行相应调整。