目的糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN)是糖尿病(Diabetes mellitus,DM)最主要的微血管并发症之一。目前关于DN机制的研究涉及诸多方面,其中肾小球屏障功能的损害是导致蛋白尿的直接原因,而肾小球内皮细胞则是肾小球滤过膜的重要组成部分。本研究选用高糖高脂饲料喂养联合小剂量链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)尾静脉注射建立T2DM和DN大鼠模型为研究对象,予雷公藤多苷(TWP)联合小檗碱(BBR)分别于正常白蛋白尿期和微量白蛋白尿期进行干预,探讨其对肾小球内皮细胞相关因子单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)的影响。方法清洁级雄性SD大鼠260只,随机选取20只分别作为预防组正常对照组(PNC组,n=10)、治疗组正常对照组(TNC组,n=10),以常规饲料喂养。其余240只大鼠以高糖高脂饲料喂养,8周后予STZ(30mg/kg)尾静脉注射建立T2DM模型。将成模大鼠随机分为预防(P)组和治疗(T)组,各120只大鼠。预防组分为模型对照(PDM)组、雷公藤多苷单药组、小檗碱单药(PB,BBR 150mg/kg·d)组和雷公藤多苷联合小檗碱组。其中雷公藤多苷单药组根据应用雷公藤多苷的剂量进一步分为低(TWP1mg/kg·d)、中(TWP3mg/kg·d)、高(TWP6mg/kg·d)剂量(PTL、PTM、PTH)组;雷公藤多苷联合小檗碱组根据应用雷公藤多苷的剂量进一步分为低剂量雷公藤多苷联合小檗碱(PTBL,TWP1mg/kg·d+BBR150mg/kg·d)组、中剂量雷公藤多苷联合小檗碱(PTBM,TWP3mg/kg·d+BBR150mg/kg·d)组、高剂量雷公藤多苷联合小檗碱(PTBH,TWP6mg/kg·d+BBR150mg/kg·d)组,每组各15只,成模后即开始灌胃,正常对照(PNC)组和模型对照(PDM)组以等量蒸馏水(2ml)灌胃,灌胃8周末处死取材。治疗组分为模型对照(TDM)组、雷公藤多苷单药组、小檗碱单药(TB,BBR 150mg/kg·d)组,雷公藤多苷联合小檗碱组。其中雷公藤多苷单药组根据应用雷公藤多苷的剂量进一步分为低(TWP 3mg/kg·d)、中(TWP 6mg/kg·d)、高(TWP 9mg/kg·d)剂量(TTL、TTM、TTH)组;雷公藤多苷联合小檗碱组根据应用雷公藤多苷的剂量进一步分为低剂量雷公藤多苷联合小檗碱(TTBL,TWP3mg/kg·d+BBR150mg/kg·d)组、中剂量雷公藤多苷联合小檗碱(TTBM,TWP6mg/kg·d+BBR150mg/kg·d)组、高剂量雷公藤多苷联合小檗碱(TTBH,TWP 9mg/kg·d+ BBR 150mg/kg·d)组,每组各15只,成模6周后开始灌胃,正常对照(TNC)组和模型对照(TDM)组以等量蒸馏水(2ml)灌胃,灌胃8周末处死取材。实验过程中记录大鼠体重(BW)、血糖、24小时尿微量白蛋白(UMA)变化;处死取材时记录BW、肾重(KW);留取血标本检测血糖、肝肾功能、血脂、血常规;采用ELISA法检测大鼠血清中MCP-1、VCAM-1水平;留取肾组织标本,电镜观察大鼠肾组织肾小球滤过膜超微结构改变,分别应用RT-PCR法、Western Blotting法和免疫组化法检测大鼠肾组织中MCP-1和VCAM-1的mRNA和蛋白的表达。结果1.高糖高脂饲料喂养8周后大鼠血脂、胰岛素水平和HOMA-IR、HOMA-β指数较常规饲料组明显升高(P<0.05);STZ注射后,高糖高脂饲料喂养大鼠血糖明显升高,体重明显减轻,同时伴有多饮、多尿、多食等症状,成模6周后实验大鼠24h尿微量白蛋白明显升高。2.一般指标:①体重、血糖:与PNC、TNC组相比,预防和治疗各组大鼠造模后血糖明显升高(P<0.05),体重明显下降(P<0.05),雷公藤多苷和小檗碱灌胃对大鼠体重、血糖未见显著影响(P>0.05);②肾重指数(KW/BW):与PNC、TNC组相比,PDM和TDM组大鼠KW/BW均明显升高(P<0.05),预防组大鼠经雷公藤多苷和小檗碱灌胃后KW/BW均有所下降(P<0.05),以PTH组下降最为明显;治疗组大鼠经雷公藤多苷和小檗碱灌胃后,TTH组、TB组及雷公藤多苷联合小檗碱各组(TTBL、TTBM、TTBH)大鼠KW/BW下降有统计学差异(P<0.05);③血脂:与PNC、TNC组相比,糖尿病各组大鼠甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)水平显著升高(P<0.05),雷公藤多苷和小檗碱灌胃后未见显著影响(P>0.05):④肝、肾功能、血常规:大鼠肝、肾功能和血常规在各组间均无明显差异(P>0.05),雷公藤多苷和小檗碱灌胃后未见显著影响(P>0.05)。3.24h尿微量白蛋白(UMA):①预防组:与PNC组相比,糖尿病各组大鼠UMA水平明显升高(P<0.05);与PDM组相比,雷公藤多苷单药各组、小檗碱单药组和雷公藤多苷联合小檗碱各组大鼠UMA水平明显降低(P<0.05),且呈剂量依赖性;②治疗组:与TNC组相比,糖尿病各组大鼠UMA水平明显升高(P<0.05);与TDM组相比,雷公藤多苷单药各组和雷公藤多苷联合小檗碱各组大鼠UMA水平明显降低(P<0.05),呈剂量依赖性。4.电镜观察肾小球滤过膜变化:正常对照组大鼠肾小球内皮细胞数量、形态、毛细血管腔的大小和内容物未见明显异常。糖尿病各组大鼠可见肾小球内皮细胞增生肿胀呈拥塞状,向管腔内突出等早期DN肾小球内皮细胞超微结构改变,治疗组较预防组相比更为严重。雷公藤多苷单药各组、小檗碱组和雷公藤多苷联合小檗碱各组上述病理性超微结构均有所改善。5.采用ELISA法检测大鼠血清中MCP-1、VCAM-1水平:①预防组:与PNC组相比,糖尿病各组大鼠血清MCP-1、VCAM-1水平明显升高(P<0.05);与PDM组相比,PTH、PTBM和PTBH组大鼠血清MCP-1、VCAM-1水平显著下降(P<0.05);②治疗组:与TNC组相比,糖尿病各组大鼠血清MCP-1、VCAM-1水平明显升高(P<0.05);与TDM组相比,大鼠血清MCP-1水平以TTH、TTBL、TTBM和TTBH组下降明显(P<0.05),而大鼠血清VCAM-1水平在TTM、TTH、TTBL、TTBM和TTBH组显著下降(P<0.05)。6.应用RT-PCR法检测大鼠肾组织中MCP-1、VCAM-1mRNA的表达:①预防组:与PNC组相比,糖尿病各组大鼠肾组织中MCP-1、VCAM-1mRNA表达明显升高(P<0.05);与PDM组相比,雷公藤多苷单药各组、小檗碱单药组和雷公藤多苷联合小檗碱各组大鼠肾组织中MCP-1、VCAM-1mRNA表达明显降低(P<0.05),且呈剂量依赖性;②治疗组:与TNC组相比,糖尿病各组大鼠肾组织中MCP-1、VCAM-1mRNA表达明显升高(P<0.05);与TDM组相比,雷公藤多苷单药各组和雷公藤多苷联合小檗碱各组大鼠肾组织中MCP-1、VCAM-1mRNA表达明显降低(P<0.05),呈剂量依赖性。7.应用WesternBlotting法检测大鼠肾组织中MCP-1、VCAM-1蛋白的表达:①预防组:与PNC组相比,糖尿病各组大鼠肾组织中MCP-1、VCAM-1蛋白表达明显升高(P<0.05);与PDM组相比,雷公藤多苷单药各组、小檗碱单药组和雷公藤多苷联合小檗碱各组大鼠肾组织中MCP-1、VCAM-1蛋白表达明显降低(P<0.05),且呈剂量依赖性;②治疗组:与TNC组相比,糖尿病各组大鼠肾组织中MCP-1、VCAM-1蛋白表达明显升高(P<0.05);与TDM组相比,雷公藤多苷单药各组和雷公藤多苷联合小檗碱各组大鼠肾组织中MCP-1、VCAM-1蛋白表达明显降低(P<0.05),呈剂量依赖性。8.应用免疫组化法检测大鼠肾组织中MCP-1、VCAM-1蛋白的表达:与PNC、TNC组相比,糖尿病各组大鼠肾小球中均可见标记的MCP-1、VCAM-1细胞浸润(P<0.05);雷公藤多苷灌胃后大鼠肾组织中MCP-1、VCAM-1表达明显降低(P<0.05),中、高剂量雷公藤多苷(PTM、PTH、TTM、TTH)组下降明显;应用小檗碱灌胃后,在预防组观察到小檗碱作用明显(P<0.05),而在治疗组单纯小檗碱灌胃效果不明显(P>0.05):雷公藤多苷联合小檗碱各组大鼠肾组织中MCP-1、VCAM-1表达明显降低(P<0.05),中、高剂量雷公藤多苷联合小檗碱(PTBM、PTBH、TTBM和TTBH)组效果显著。结论1.通过高糖高脂饮食联合小剂量STZ,成功制备T2DM和DN模型。2.电镜结果显示DN大鼠肾小球内皮细胞超微结构改变,同时大鼠肾组织中MCP-1、VCAM-1的mRNA水平和蛋白的表达明显升高,提示肾小球内皮细胞相关细胞因子和黏附分子的改变与DN发生发展具有相关性。3.雷公藤多苷单药、小檗碱单药或二者联合应用可降低预防组大鼠尿蛋白水平,延缓DN发生,雷公藤多苷单药或联合小檗碱干预可降低治疗组大鼠尿蛋白水平,减慢DN发展,而单独应用小檗碱对治疗组大鼠效果不明显。且实验大鼠应用各剂量雷公藤多苷及小檗碱灌胃后均未观察到明显的肝肾损害和外周血细胞减少,安全性良好。4.应用雷公藤多苷和小檗碱干预可减少以MCP-1、VCAM-1为代表的肾小球内皮细胞相关的细胞因子和黏附分子的表达,减轻内皮细胞炎症反应,修复滤过膜结构,延缓DN发生,减慢DN发展。