论文部分内容阅读
植物在非生物胁迫条件下,体内发生一系列的生理生化变化,诱导与抗逆相关的功能基因的表达。转录因子是一类在信号传递及相关功能基因的表达调控中起重要作用的蛋白质。植物中存在多种与逆境胁迫相关的转录因子。DREB类转录因子(Dehydration Responsive Element Binding protein)在干旱、高盐、低温等逆境条件下诱导表达,它能够识别与非生物逆境相关的一系列基因启动子区域中的DRE(Dehydration Responsive Element)顺式作用元件,激活下游基因的表达。利用DREB转录因子改良植物的抗逆性,可获得更为理想的效果。
库拉索芦荟(Aloe vera L)具有很强的抗旱能力,体内存在多种高抗性基因,但对于其抗寒能力的研究尚未有相关的报导。本实验利用 RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)技术从库拉索芦荟中克隆了一个低温诱导的DREB类转录因子基因,命名为Aloe DREB1(GenBank注册号为DQ981484)。Aloe DREB1的cDNA序列全长1013bp,含有一个完整的开放阅读框,编码211个氨基酸,对推测的氨基酸序列分析显示,其编码的蛋白包含一个典型的AP2 DNA结合结构域(DNA-binding domain,DNA-BD),一段可能作为核定位信号(nuclear localization signal,NLS)的碱性氨基酸区域,以及 C 末端的酸性激活区 (transcriptional activation domain,AD),属于EREBP/AP2转录因子家族。
基因表达特性分析表明,Aloe DREB1受低温诱导表达,低温处理0.5h后表达产物的量开始积累,到12h表达量达到最大,到24h又下降到未处理时的表达水平。
为分析Aloe DREB1的DNA结合特异性及转录激活功能,将其cDNA全长构建到酵母表达载体YepGAP上,转化带有突变型及野生型DRE顺式作用元件的酵母报道子菌株,通过报告基因His3核LacZ的表达情况可以看出,Aloe DREB1可以特异识别结合DRE顺式作用元件,激活下游报告基因的表达,但其转录激活作用较弱。
为研究Aloe DREB1转录因子亚细胞定位的情况,本实验采用与绿色荧光蛋白 (Green Fluorescent Protein,GFP)融合表达的方法,将Aloe DREB1基因的cDNA构建到GFP融合表达载体上,通过基因枪转化洋葱表皮细胞,激光共聚焦显微镜观察的结果表明,转化了熏组载体的洋葱表皮细胞只有细胞核中有荧光信号,而转入了空载的GFP载体的洋葱表皮细胞在整个细胞中均有荧光信号。说明Aloe DREB1转录因子定位在细胞核中,但要确定是否是推测的核定位信号(NLS)起到核定位功能还有待进一步研究。对库拉索芦荟低温诱导的DREB转录因子基因的克隆及基因功能的分析,加深了我们对百合科植物在逆境条件下DREB类转录因子的调控作用的理解,为今后应用基因工程手段改良特定植物的抗逆性奠定了基础。