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研究背景皮肤组织是人体阻挡外界物质的重要屏障,为人体稳态提供重要保证。其中主要为角质形成细胞、成纤维细胞、朗格汉斯细胞和黑色素细胞等4种细胞。人体皮肤作为阻挡外界物质干扰的第一道关卡,会通过某些特殊反应进行防御。接触性过敏性皮炎,是一种由外源物质引发的IV型过敏反应,是化学品分类标识、化妆品和皮肤接触产品毒性评价的重要内容。接触性过敏性皮炎是皮肤致敏的直接临床表现,人群中有15-20%的皮肤致敏发生率,而引起这类反应的物质在生活环境中随处可见。因此对物质成分致敏能力的筛查就变得非常重要。豚鼠实验(例如:豚鼠的最大剂量实验)是最为常用的筛查物质致敏性的动物实验,目前,优化后的小鼠局部淋巴结实验(LLNA),以一种早期的预测工具逐步应用在风险评估中。然而,随着新的欧洲的化妆品法规(第七次欧洲化妆品指令修订案)颁布关于动物实验在化妆产品中的禁令,某些地区化妆产品的皮肤致敏动物实验得到禁止。如此情势下,许多非动物的皮肤致敏筛查实验逐步得到开发利用和法规认可。由于皮肤致敏机制的复杂性,同一个体外测试系统中很难全面反映整个致敏过程,所以,体外实验的开发需要考虑针对不同的反应层次进行描述(例如:化学物质的皮肤渗透、蛋白质/多肽结合、特异性抗原免疫反应的起始),如此才能够将体内致敏的过程以一种有害结局通路(AOP)的形式通过系列实验进行模拟。皮肤致敏的诱导阶段,朗格汉斯细胞(LC)起着决定性的作用,通过呈递和修饰抗原承担着启动免疫反应的作用。在这个过程中,LC成熟表现为:II型组织相容性复合物(MHC)的上调、共刺激分子的表达上调(CD86、CD54、CD80和CD40),同时还有IL-18表达增加的现象。许多抗原特异性的免疫反应方法使用的是树突状细胞(DCs),其中包括LC。相关研究尝试使用这类原代细胞,但是由于捐献者的差异性问题,导致该细胞在体外实验系统中存在不稳定性。为避免此类问题,通过一些DCs细胞系进行模拟该类细胞,例如:THP-1细胞、U937细胞(人组织细胞性淋巴瘤细胞系)、KG-1细胞(人骨髓性白血病细胞系)和MUTZ-3(人单核细胞系)。本研究基于THP-1细胞的皮肤致敏检测方法(h-CLAT),联合Ha Ca T角质细胞和EpiskinTM皮肤模型进行皮肤致敏筛查实验,通过THP-1细胞表面CD86/CD54的改变对物质的致敏情况进行判断。研究目的构建体外培养的h-CLAT皮肤致敏检测系统,并分别结合Ha Ca T角质细胞和EpiskinTM皮肤模型,塑造不同的皮肤致敏整合测试方法。通过监测暴露受试物后的细胞活率、白介素18(IL-18)表达情况、细胞表面标志物CD54/CD86表达情况和相对荧光强度,建立基于h-CLAT的皮肤致敏实验整合测试体系,为化学品和个人护理产品的皮肤致敏特性提供预测和评估。研究内容与方法第一部分、h-CLAT皮肤致敏检测方法的研究1.细胞培养:THP-1细胞:使用RPMI1640培养基,加入10%的胎牛血清(FBS),25m M 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES),0.05m M巯基乙醇和1%青霉素-链霉素(双抗)。2.物质筛查:使用非致敏物:十二烷基磺酸钠、乳酸;弱致敏物:肉桂醇、丁香酚;中等致敏物:柠檬醛、肉桂醛、苯乙醛;强致敏物:没食子酸丙酯、马来酸酐;极强致敏物:苯醌、二硝基氯苯进行h-CLAT皮肤致敏的方法构建。建立方法后对样品:微乳卸妆液、松茸提取物、当归提取物和黄芩提取物进行预测。第二部分、联合Ha Ca T角质细胞系和h-CLAT的皮肤致敏检测方法研究1.细胞培养:Ha Ca T角质细胞:使用RPMI1640培养基,10%的胎牛血清(FBS)和1%青霉素-链霉素(双抗);THP-1细胞与Ha Ca T细胞共培养采用BD Falcon插入式培养皿于12孔细胞培养板培养中孵育。2.物质筛查:使用十二烷基磺酸钠、丁香酚、肉桂醛和二硝基氯苯处理Ha Ca T角质细胞,分别获取4种物质对应的IC50;采用IL-18检测试剂盒检测上述4种物质作用后的Ha Ca T角质细胞和共培养系统的IL-18表达情况;构建Ha Ca T角质细胞与THP-1细胞的共培养皮肤致敏方法,并对上述4种物质的致敏性进行检测。第三部分、联合EpiskinTM皮肤模型和h-CLAT的皮肤致敏检测方法研究1.皮肤模型培养:EpiskinTM皮肤模型:使用MEM培养基,该培养基为购买皮肤模型时附带。与THP-1细胞于12孔细胞培养板培养中共同孵育。2.物质筛查:使用十二烷基磺酸钠、丁香酚、肉桂醛和二硝基氯苯处理该共培养皮肤致敏检测系统,并与Ha Ca T角质细胞和THP-1细胞共培养系统的检测结果进行对比。最后,将建立的共培养系统对6种清洁类产品进行皮肤致敏性检测。研究结果第一部分、h-CLAT皮肤致敏检测方法的研究本研究对THP-1细胞进行了9种皮肤致敏阳性物质和2种皮肤致敏阴性物质的暴露,并对作用下的细胞活率、细胞表面分子CD54和CD86进行检测,并获得相应的引起致敏反应的最低浓度EC150(CD86)和EC200(CD54)。方法顺利构建后,通过该方法对微乳卸妆液、松茸提取物、当归提取物和黄芩提取物进行了皮肤致敏检测,并判断当归和黄芩提取物为阳性物质,另外两种为阴性物质。第二部分、联合Ha Ca T角质细胞系和h-CLAT的皮肤致敏检测方法研究本实验中引入Ha Ca T角质细胞,并对受试物作用下角质细胞产生的炎性因子IL-18进行检测,发现其在单层角质细胞和共培养体系中都显著增加(P<0.05)。随后,将无毒性情况下的IL-18联合DNCB作用THP-1细胞,结果与单独DNCB处理组并无显著性差异(P>0.05)。后续对两种细胞的共培养系统分别检测SLS、丁香酚、肉桂醛和DNCB,发现相对h-CLAT皮肤致敏系统,共培养系统的CD86/CD54荧光强度并未显著增强(P>0.05)。但是,该模型同一条件下可以检测物质的刺激性和致敏性,同时也为构建后续皮肤模型测试体系起到初筛受试物浓度的作用。第三部分、联合EpiskinTM皮肤模型和h-CLAT的皮肤致敏检测方法的研究为了优化Ha Ca T角质细胞与THP-1细胞的共培养模型,使用具有生物活性的皮肤三维结构模型EpiskinTM与THP-1细胞进行4种物质的皮肤致敏性检测。最终发现,3种阳性物质在皮肤模型整合h-CLAT测试条件下,相较于单纯的THP-1细胞皮肤致敏检测系统和THP-1细胞与Ha Ca T角质细胞共培养系统,相对荧光强度增加显著(P<0.05)。最后,使用该模型对6种清洁类护理品进行了皮肤致敏检测。研究结论本研究通过已知的9种皮肤致敏阳性标准物质和2种阴性物质建立了h-CLAT皮肤致敏测试方法,并对4种样品进行区分。同时,为了强化单一细胞检测体系,加入Ha Ca T角质细胞构建共培养模型,并对3种皮肤致敏阳性物质和1种阴性物质进行了准确区分,成功构建了基于IL-18细胞因子的皮肤刺激性和皮肤致敏性联合检测系统。最后,为更加契合化妆产品和个人护理品等物质对人体皮肤的作用条件,联合皮肤模型与THP-1细胞构建三维皮肤致敏评估结构,并对3种皮肤致敏阳性物质、1种阴性物质和6种清洁类成品进行了区分,结果表明该系统能够对皮肤致敏物质做出正确判断,并且相对上述两个检测系统受试物的检测类型更丰富。