目的:转录因子E2-相关因子(Nuclear factor E2-Related factor,Nrf2)是一个重要的转录因子,它可以通过调控一系列抗氧化酶和解毒酶来对抗氧化应激,维持细胞内氧化还原稳态,并参与调控许多重要的生理反应。Nrf2缺失的小鼠更易发生急慢性毒性损伤以及氧化应激相关疾病。Nrf2激动剂可活化Nrf2介导的适应性抗氧化反应起到预防氧化应激相关疾病发生的作用。目前有四种Nrf2激动剂作为药物进入临床试验阶段,其中富马酸二甲酯已被FDA批准应用于治疗多发性硬化症。随着研究的不断深入,Nrf2的负面作用逐渐被人们发现。有研究发现多种肿瘤组织中Nrf2表达升高,且Nrf2的持续激活与肿瘤的发生发展及放化疗耐药性相关。通过应用小分子化合物来抑制Nrf2信号通路可能是提高肿瘤放化疗敏感性的有效方法。现有对于Nrf2抑制剂的研究较少,对于Nrf2信号通路的抑制作用多不明确,且它们的安全性及特异性也是向临床试验推进的一个阻碍。另外我们已知环境中存在的化合物会在日常生活中通过不同途径进入人体,对人类健康产生负面影响,其中大部分化合物诱导的机体损伤是由氧化应激引起的。作为调控细胞氧化还原稳态的核心,Nrf2-ARE信号通路会对不同类型的环境氧化应激物作出相应的反应。一些化合物可能通过刺激细胞产生大量活性氧自由基ROS来引起Nrf2信号通路的适应性活化,而一些可能直接作用于Nrf2信号通路导致细胞内氧化还原稳态的破坏。因此,对于细胞内ROS的水平及Nrf2-ARE活性的测定有助于对环境氧化应激物的分类及评价,并为其导致的健康负面影响提供预防措施或为其致病机制提供理论研究依据。研究方法:1.建立Nrf2-ARE活性调节剂及环境氧化应激物筛检确证平台:首先构建多段重复ARE序列的荧光素酶报告基因重组质粒,应用慢病毒转染的方法,在人肝癌细胞系HepG2及人表皮角质细胞系Ha Cat细胞中建立稳定表达ARE荧光素酶的细胞系。根据前期对Nrf2信号通路的研究基础,制定高效可行的Nrf2-ARE活性调节剂筛选策略。对已购入化学品库中七千五百种化合物进行ARE荧光素酶活性测定。初筛实验中,应用10μM化合物在384孔板中处理细胞6 h,随后用酶标仪检测荧光素酶活性。氧化应激物评价平台中,应用DCFH-DA探针法检测细胞内的ROS水平。在96孔板中化合物处理细胞1 h及6 h后收取细胞,随后用酶标仪检测探针的荧光强度。通过检测化合物对ARE活性与细胞内ROS水平的影响,将他们进行分类评价。2.Nrf2-ARE活性候选调节剂的确证实验:对Nrf2-ARE候选抑制剂进行复筛,在HepG2-ARE细胞中应用1.25、2.5和5μM的化合物处理HepG2-ARE细胞6 h,检测ARE荧光素酶活性。随后选取抑制作用明显的化合物,检测这些化合物在更低剂量是否可影响ARE荧光素酶活性。随后在肿瘤细胞HepG2、A549和非肿瘤细胞HaCat中,对候选抑制剂进行24 h细胞活力测定,选择最大无毒性剂量处理细胞4 h或6 h,分别检测Nrf2的蛋白及Nrf2及其下游基因GCLC和GCLM的mRNA变化。对于Nrf2-ARE候选激动剂的研究由于在专利申请阶段,并未放入此论文中。3.Nrf2-ARE活性候选抑制剂的Nrf2通路特异性及抑制作用机制研究:确定候选抑制剂的抑制作用后,用具有抑制Nrf2通路的相同剂量处理A549细胞,检测其他短半衰期蛋白如p53、Survivin的表达以及其他通路如NFE2L1及其下游基因PSM家族的mRNA水平。对于Nrf2候选抑制剂的作用机制研究,用候选抑制剂处理A549细胞系的同时,用RNA合成抑制剂ActD或蛋白合成抑制剂CHX处理细胞,分别检测不同时间点Nrf2的mRNA水平及蛋白水平变化。4.在临床肺癌标本及体内外肺癌实验模型中探究Nrf2在肿瘤发生发展及化疗耐药性中的作用:首先在临床收集的10组肺癌标本中(癌组织、癌旁组织和远癌旁组织),提取组织RNA及蛋白,检测Nrf2及其下游基因的mRNA和蛋白表达。检测三种肺癌细胞系中Nrf2信号通路的基础表达水平,以及化疗药物三氧化二砷处理细胞24 h后的细胞活力变化。随后我们在小鼠Lewis肺癌3LL细胞中建立了稳定敲除Nrf2的细胞系,检测三种肺癌常用化疗药物处理细胞24 h后的细胞活力变化。最后应用Nrf2-KD的细胞系进行小鼠体内荷瘤实验,将16只雄性C57BL/6小鼠分为两组,每只小鼠于右前肢腋下部位皮下注射1×10~6个SCR或Nrf2-KD细胞。接种第七天后每两日测量小鼠体重及肿瘤大小,第20天收取小鼠,分离皮下肿瘤进行称重及照片采集。5.Nrf2-ARE活性候选抑制剂的实验应用研究:在人A549及小鼠3LL细胞中,应用候选抑制剂及不同剂量化疗药物处理细胞24 h,检测候选抑制剂对化疗药物引起的细胞毒性的影响。在A549细胞中,应用实时无标记动态细胞分析技术,监测候选抑制剂与化疗药物联合应用对肿瘤细胞生长的影响。随后应用3LL细胞在C57BL/6小鼠上进行荷瘤实验,从第九天开始每两天进行腹腔注射给药,共分为4个实验组:对照组,TPL组,化疗药物组(Cisplatin或Epirubicin),联合给药组(TPL+化疗药物)。给药5次后,在第19天收取小鼠,检测指标同方法4。同时对小鼠血清中ALT及AST水平进行检测以评价药物毒作用。结果:1.ARE荧光素酶报告基因稳转细胞系建立及化学品库的初筛结果:首先我们用已知的Nrf2活性激动剂姜黄素及tBHQ处理稳定转染ARE荧光素酶报告基因的细胞系,ARE荧光素酶活性显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05),说明细胞系建立成功。随后用化学品库7500种化合物处理HepG2-ARE细胞,检测6 h后ARE荧光素酶活性变化。其中ARE活性升高至150%以上,作为ARE活性候选激动剂,ARE活性降低至50%以下为ARE活性候选抑制剂;2.环境氧化应激物分类及评价平台的建立及ROS水平测定:以三种Nrf2通路相关的典型化合物亚砷酸钠、乙硫异烟胺及喜树碱为例对环境氧化应激物的平台建立及筛检策略进行说明。亚砷酸钠可提高ARE荧光素酶活性,且具有剂量反应关系,差异具有统计学意义(P<0.05)。用亚砷酸钠处理细胞1 h后可明显增加细胞内ROS水平,差异具有统计学意义(P<0.05),而6 h时ROS水平无改变。这与本实验室前期的研究结果一致,说明我们成功建立了96孔板检测细胞内ROS水平的方法。Nrf2-ARE活性抑制剂乙硫异烟胺可降低ARE活性,1 mM ETH处理1 h及6 h都引起细胞内ROS的累积,差异具有统计学意义(P<0.05)。而Nrf2-ARE活性抑制剂喜树碱处理后降低ARE活性的同时也使细胞内ROS水平下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。结合ARE活性及细胞内ROS水平,我们可将他们分为四类。亚砷酸钠为ARE激动型氧化应激物,这类化合物会通过引起过量ROS产生导致氧化应激损伤,同时会活化以Nrf2为代表的适应性抗氧化反应;乙硫异烟胺为ARE活性抑制型氧化应激物,其可引起细胞内ROS的产生,并且由于抑制Nrf2-ARE介导的抗氧化反应,进而导致氧化应激状态的持续存在;喜树碱为未引起氧化应激的ARE活性抑制剂,这类化合物可能通过多种机制直接影响Nrf2及其信号通路表达水平,且不使细胞内产生ROS的累积,说明其具有较大的安全性。另有一部分化合物为未影响ROS水平的ARE激活型化合物。这类化合物可能通过影响Nrf2/Keap1之间蛋白连接等机制,只激活了Nrf2的水平,但不影响细胞内ROS水平,认为是安全性较高的Nrf2激活剂。3.复筛确证实验证明候选抑制剂TPL及ANM可抑制Nrf2-ARE活性:在HepG2-ARE细胞中,通过对Nrf2-ARE活性候选抑制剂进行复筛实验,我们发现极低剂量(0.05μM)的候选抑制剂TPL和ANM可以降低ARE荧光素酶活性,差异具有统计学意义(P<0.05)。在肿瘤细胞HepG2及A549中,无毒性剂量的TPL可降低Nrf2及其下游基因的mRNA水平和Nrf2的蛋白水平,且成剂量反应关系,差异具有统计学意义(P<0.05),而在非肿瘤细胞Ha Cat中无此作用。无毒性剂量的抑制剂ANM在这三种细胞系中均可抑制Nrf2的蛋白表达水平,但对Nrf2及其下游基因的mRNA水平无影响。提示TPL及ANM均可抑制Nrf2信号通路,但作用机制不同。5.抑制剂TPL对Nrf2信号通路的抑制作用具有特异性:在抑制Nrf2蛋白水平的同时,候选抑制剂ANM也可显著地降低其他短半衰期蛋白的表达,不具有Nrf2抑制作用的特异性;而TPL对其他短半衰期蛋白无影响,也对NFE2L1及其下游PSM家族mRNA水平无影响。对于TPL的作用机制研究中,TPL可降低Nrf2的mRNA水平,但未影响Nrf2的mRNA。可能的机制为TPL影响了Nrf2的转录或转录后调控,仍需进行进一步研究。6.肺癌细胞中Nrf2的高表达会加快肿瘤的生长并降低化疗敏感性:在临床收集的10对新鲜肺癌组织标本中,部分患者的Nrf2及其下游基因GCLC的mRNA及蛋白水平在癌组织中高于癌旁组织,但差异不具有统计学差异(P>0.05)。需要再继续收集更多标本,并根据肿瘤不同分期或分型来进行统计分析。在对三种人非小细胞肺癌细胞系的研究中,A549的Nrf2及其下游基因的表达水平最高,其对三氧化二砷所致的细胞毒性敏感性最低,H1275的Nrf2表达水平居中,具有最低Nrf2基础水平的H1299,相同剂量三氧化二砷处理后,它的细胞活力最低,差异具有统计学意义(P<0.05)。说明肿瘤细胞内Nrf2的表达水平越高其对化疗药物的敏感性越差。在小鼠Lewis肺癌细胞3LL中,与SCR细胞相比,相同剂量化疗药物处理后,Nrf2-KD细胞系的细胞活力更低,对化疗药物更敏感,差异具有统计学意义(P<0.05)。小鼠体内荷瘤实验中,与接种SCR细胞的小鼠相比,接种Nrf2-KD细胞的小鼠肿瘤体积显著减小,差异具有统计学意义(P<0.05)。7.抑制剂TPL可提高肿瘤对化疗药物细胞毒性的敏感性:A549及3LL细胞中,与对照组相比,TPL处理组可降低相同剂量化疗药物处理的细胞活力,差异具有统计学意义(P<0.05),说明TPL可提高肿瘤细胞化疗药物敏感性。实时无标记动态细胞分析实验再次证明相同结果。体内实验中,TPL或者化疗药物单独处理组可稍减缓肿瘤的生长速度,降低肿瘤大小,但并无统计学差异。而TPL与化疗药物Cisplatin或Epirubicin联合处理组,均可明显减缓肿瘤生长,降低肿瘤大小,差异具有统计学意义(P<0.05)。并且各组之间小鼠体重、血清AST及ALT水平并无差异,说明给药期间未出现毒性。结论:1.成功建立以ARE荧光素酶活性为核心的高通量筛选平台,并结合检测氧化应激水平,来实现筛检Nrf2-ARE活性调节剂和对环境氧化应激物的分类及评价。2.应用Nrf2-ARE活性筛检平台发现低毒性高特异性的新型Nrf2-ARE活性抑制剂TPL,其在体内外肺癌模型中,可通过抑制Nrf2信号通路水平显著提高肿瘤对化疗药物的敏感性,为未来临床肿瘤治疗提供新方向。