背景目的乳腺癌为严重危害全球女性健康的恶性肿瘤,全球每年约有100万妇女患乳腺癌,约有40万人死于该病,其发病率逐年上升,且年龄趋于年轻化。发达国家为乳腺癌高发区,我国虽属乳腺癌低发地区,但发病率仍居女性恶性肿瘤首位。21世纪,我国乳腺癌发病率城市高于农村,经济发达地区的发病率更高。手术、放疗、化疗、内分泌、生物治疗及中医中药治疗为当今乳腺癌的主要治疗方法,化疗在其中占重要地位,而乳腺癌细胞对化疗药物耐药已为乳腺癌治疗不能取得治愈性疗效的最主要原因。近10年来,许多学者致力于乳腺癌的多药耐药性研究,发现乳腺癌多药耐药基因(MDR1)及其编码的糖蛋白(P-gp)是引起乳腺癌耐药的主要原因。因此,寻找耐药逆转剂、增强化疗疗效是肿瘤化疗急需解决的重大课题。大量逆转肿瘤耐药的研究发现钙通道阻滞剂、免疫调节剂、钙调蛋白拮抗剂等药具有逆转耐药活性,但因疗效欠佳、作用靶点单一、毒副作用大等缺点难以应用于临床。中药复方因疗效确切、多靶点、毒副作用小等优点,具有很大的研究价值。从中药复方中寻找安全有效的耐药逆转剂逐渐成为当今研究热点。中药复方体外药理研究的发展,复方中药含药血清理论的提出为深入研究复方中药抗肿瘤机制开辟了新的出路。血清药理学是指将中药或中药复方经口给动物灌服一定时间后采集动物血液、分离血清,用含有药物成分的血清进行体外实验的一种半体内实验方法。该方法主要有两个特点：一是克服了用中药制剂直接进行体外实验时,中药制剂本身的理化性质对实验的干扰；二是实验结果与在体实验有较好的一致性,不仅能反映中药母体药物及其可能的代谢产物的药理作用,而且还能反映可能药物诱导机体内源性成分所产生的作用,为从细胞分子水平研究中药药理学作用提供了新的手段。中医学认为,乳腺癌属“乳岩”范畴,多表现为虚实夹杂证,表现为气、血、阴、阳不足,以及痰浊、瘀血、热毒夹杂作用的结果。恶性肿瘤本为正气虚损、阴阳失衡、脏腑功能失调所致,手术、放疗、化疗进一步损耗气血,正气受创。遂治疗上宜扶正培本,去除邪毒,改善机体内环境,减轻放化疗毒副反应及手术对机体免疫功能的抑制,调补先后天之本,调动和增强机体自身抗癌能力。大量研究证实许多中药及复方具抗肿瘤活性,不仅能提高机体免疫功能,还能抑制癌细胞的分裂,改善症状,提高患者的生存质量,延长生存期。针对乳腺癌本虚标实的病机,导师结合多年临床经验,拟制中药复方扶正消瘤颗粒,功以益气养阴扶正,解毒散结、祛瘀化痰消瘤,对乳腺癌术后放化疗增效、减轻并发症、增强免疫力,延缓肿瘤转移具有较好的疗效。方中以西洋参、灵芝、百合、黄芪益气养阴,清热生津；增强患者脾胃运化功能,补益中气；薏苡仁、猪苓、法半夏、陈皮化痰祛湿浊,助脾胃运化；三棱、莪术活血祛瘀,使瘀血去则新血生,即祛瘀生新之功；半枝莲、白花蛇舌草、山慈菇、黄药子解毒散结消瘤,清除余毒；诸药共用,益气健脾养阴,扶正固本,化痰祛瘀,解毒消瘤而达到增强免疫、减毒增效的作用。本实验通过研究扶正消瘤颗粒含药血清对乳腺癌细胞MCF-7耐药细胞体外增殖及机理的研究,为深入研究扶正消瘤颗粒临床疗效的作用机制奠定基础。方法1、采用浓度梯度试验诱导法,应用联合化疗药物(紫杉醇和表柔比星的最高血药浓度,PPC)诱导耐药MCF-7/ADM多药耐药,并研究MCF-7多耐药细胞的基本性状、细胞生长曲线及MCF-7对联合化疗药物的最大耐药浓度；2、采用动物实验常用的等效剂量折算系数公式,折算大鼠每日给药量。将扶正消瘤颗粒剂用温水配制成三种不同的倍数浓度即1倍量、2倍量、3倍量,对照组予生理盐水,连续灌胃3天,最后1次灌胃结束后60～120分钟,行下腔静脉采血制备血清；3、MTT法检测。设空白组(SFM+耐药细胞+0.35PPC, Blnak)、1倍剂量组(SFM+耐药细胞+1FZXL+0.35PPC,1FZXL)、2倍剂量组(SFM+耐药细胞+2FZXL+0.35PPC, 2FZXL)、3倍剂量组(SFM+耐药细胞+3FZXL+0.35PPC,3FZXL)；四唑盐比色法(MTT法)测定扶正消瘤颗粒含药血清抗MCF-7多药耐药细胞的体外增殖作用；各组分别于培养3、4、5、6、7天五个时间点行MTT法检测细胞吸光值(OD),比较各组间的差异；4、用RT-PCR法分别测定不同含药血清作用后耐药细胞的多药耐药基因MDR1的表达阳性率；设阴性对照MCF-7/S,阳性对照MCF-7/ADM耐药细胞及实验组Blank、1FZXL、2FZXL、3FZXL连续培养7天,采用Trizol试剂提取各组总RNA, PCR反应条件为94℃预变性2min，进入循环94℃30s,55℃30s,72℃60s,共35个循环,最后72℃延伸10min,2%琼脂糖凝胶电泳分离,溴化乙锭染色,紫外凝胶成像系统扫描,并用Gelbase电脑软件进行光密度分析,计算MDR1mRNA的相对含量。5、用WESTERN(蛋白印记)法测定敏感细胞和不同含药血清作用后耐药细胞P-GP的阳性表达。取实验培养后7d的细胞(每组细胞约1×107个),加入细胞裂解液,冰浴上超声粉碎；取出上清液(蛋白),分光光度计下测量样品的纯度；取蛋白样品各100ug上样,经SDS-PAGE电泳进行蛋白转膜,加入5%脱脂奶粉封阻90分钟,加入一抗P-gp(1：160)4℃过夜,TTBS洗膜15min×3次,加二抗37℃40分钟,TTBS洗膜15分钟×3次,加辣根过氧化物酶37℃40分钟,TTBS洗膜15分钟×3次,DAB显色。实验重复3次,UVP凝胶成像系统扫描成像,比较各条带的吸光度值。统计方法1、统计描述：计量资料数据统计用均数±标准差(x±s)；2、统计推断：计量资料的比较用one-way ANOVA,多组率的比较用K Independent Sample Test检验；3、采用SPSS 13.0软件对数据进行统计分析,P<0.05为统计学检验有显著性差异。结果1、乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADM对联合化疗药的耐药作用具有一定耐受作用；χ2=14.965, v=5, P=0.011, P<0.05,各组不同PPC对MCF-7/ADM细胞抑制率有显著差异,据平均秩次进一步推断,1.Oppc抑制效果最好,0.5ppc效果次之,0.1ppc抑制效果最差。从0.1PPC～0.35PPC 4组比较中,可知χ2=6.846,v=3,P=0.077,4组间细胞抑制率分布无显著性差异,即认为联合化疗药物在0.1PPC～0.35PPC浓度范围内对MCF-7/ADM耐药细胞增殖影响无显著差异；说明MCF-7/ADM耐药细胞对联合化疗药物浓度(PPC)的最大耐药浓度为0.35PPC。2、较大剂量扶正消瘤颗粒含药血清有明显的抑制MCF-7耐药细胞增殖作用；比较各组细胞增殖抑制率可知,NFZXL、1FZXL、2FZXL、3FZXL四组细胞抑制率有显著差异(χ2=16.129,v=3,P=0.001),且2FZXL组效果最好,3FZXL组效果次之,1FZXL组再次之,NFZXL最差(平均秩次依次为15.9、15.10、8.0、3.0)：两两比较,2FZXL与3FZXL两组抑制率差异无显著性(U统计量为10.50,W为25.50,Z=-0.419,P=0.690)。说明扶正消瘤颗粒加倍量对MCF-7耐药细胞增殖具更明显抑制作用,即可明显增强MCF-7耐药细胞对联合化疗药物的敏感性。3、扶正消瘤颗粒含药血清可通过下调MCF-7耐药细胞的多耐药基因MDR1的转录及P-gp蛋白的表达抑制细胞增殖作用。RT-PCR检测结果显示,2FZXL(1.05±0.01)与3FZXL(1.06±0.02)两组与MCF-7/ADM (2.08±0.03)细胞组相比,P<0.05,可信区间分别为(0.982,1.078)和(0.972,1.068),差异有显著意义,可认为2FZXL和3FZXL两组多药耐药基因mRNA转录水平较MCF-7/ADM组有明显下降；NFZXL (2.01±0.04)组MCF-7/ADM相比,P=0.114,两组差异无显著意义,说明2FZXL和3FZXL两组含药血清有下调MDR1 mRNA转录的作用；在P-gp糖蛋白的表达水平比较中,2FZXL和3FZXL两组的表达水平均较MCF-7/ADM组有明显下降,P<0.05,可信区间分别为(4.51,13.95)和(4.04,13.48)。认为两组均可下调乳腺癌MCF-7耐药细胞P-gp糖蛋白的表达；说明2FZXL及3FZXL组含药血清均可通过下调MDR1 mRNA转录及P-gp糖蛋白的表达而达到抑制耐药细胞增殖。结论·1、乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADM对紫杉醇和表阿霉素联合化疗药有一定的耐药作用；2、较大剂量扶正消瘤颗粒含药血清可抑制MCF-7多药耐药细胞生长增殖作用；3、扶正消瘤颗粒含药血清可通过下调MCF-7耐药细胞的MDR1的转录及P-gp蛋白的表达而MCF-7耐药细胞生长增殖。