目的:角膜是如何维持其透明性的机制仍不清楚。角膜晶体蛋白(酶类晶体蛋白)在脊椎或无脊椎动物角膜中表达并在角膜的透明性中起重要作用。本实验重点研究3种经典晶状体晶体蛋白(非酶类晶体蛋白),即α、β、γ-晶体蛋白,是否参与小鼠和人类角膜的透明性。方法:利用Balb/c和C57BL/6小鼠,分别用缝线和化学烧伤诱导角膜新生血管模型,应用基因芯片和实时荧光定量PCR(RT-Q-PCR)技术检测相关基因的表达变化;在角膜或培养的角膜细胞中,应用RT-Q-PCR检测晶状体晶体蛋白和角膜晶体蛋白的m RNA表达水平,应用免疫组化(IHC)或蛋白质印迹法检测他们的蛋白表达水平。结果:通过基因芯片或RT-Q-PCR技术检测到晶体蛋白基因在角膜或培养的角膜细胞中丰富表达,也可以通过IHC或蛋白质印迹法检测到αA-,β-和γ-晶体蛋白在角膜或培养的角膜细胞中表达。在缝线和化学烧伤诱导的新生血管模型中,晶状体晶体蛋白基因表达表现出时间和种属的依赖性改变模式,且与角膜晶体蛋白的改变不同。外源性氧化或炎性刺激如H2O2和脂多糖能影响角膜细胞中晶状体晶体蛋白的表达。结论:α、β、γ-晶体蛋白在维持哺乳动物角膜透明性起重要作用。相关机制的进一步研究将有助于揭开角膜透明性的奥秘。目的:在几种常用的小鼠角膜病变模型中,为实时荧光定量PCR(RT-Q-PCR)筛选稳定表达的内参基因。方法:利用Balb/c和C57BL/6小鼠建立本实验室常用的角膜病变模型,1)、角膜新生血管模型(CorNV),分别采用缝线和化学烧伤诱导的角膜新生血管模型;2)、真菌角膜炎模型,分别采用白色念珠菌和烟曲霉菌诱导的真菌角膜炎模型;3)、角膜贯通伤诱导的角膜创伤模型。应用基因芯片和RT-Q-PCR检测8个常用内参基因(甘油三磷酸脱氢酶(GAPDH)、β-肌动蛋白(ACTB)、乳酸脱氢酶(ALDHA)、核糖体蛋白L5(RPL5)、泛素C(UBC)、肽基异构酶A(PPIA)、TATA盒结合蛋白(TBP1)和次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT1))在每个模型不同时间点的表达变化情况,采用geNorm和NormFinder统计软件分析RT-Q-PCR的结果。结果:基因芯片结果分析显示,在角膜新生血管状态下,8个内参基因的稳定性依次:PPIA>RPL5>HPRT1>ACTB>UBC>TBP1>GAPDH>LDHA。RT-Q-PCR的结果分析显示:在8个内参基因中,没有一个基因在所有实验条件下是恒定表达的,在大部分实验条件下,GAPDH和ACTB表达最不稳定。NormFinder和geNorm在不同角膜模型中分别推荐最佳单个内参基因和成对内参基因。NormFinder推荐PPIA在CorNV和PCI模型中为最佳内参基因,UBC在真菌角膜炎模型中为最佳内参基因。GeNorm分析结果显示,在不同模型或在不同品系小鼠建立同一模型中,其最佳内参基因就不一样。在CorNV in Balb/c和C57BL/6模型中,GeNorm分别推荐PPIA&HRPT1和PPIA&RPL5作为最佳内参基因;白色念珠菌和烟曲霉菌诱导的真菌角膜炎模型中,GeNorm分别推荐UBC&HPRT1和UBC&LDHA作为最佳内参基因。结论:在进行角膜相关研究,为RT-Q-PCR选取最佳内参基因有利于角膜相关表达基因的研究;在没有最适内参基因的情况下,可选取PPIA,UBC或结合HPRT1、RPL5作为内参基因。