食管癌(esophageal cancer,EC)占全球肿瘤相关死亡的第六位,具有广泛的地域分布性,其最高的发病率分布在中国的北部和中部地区,特别是河南和山西。目前,食管癌包括两种主要的组织学类型,即食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma,EA)。多于90%的食管鳞癌分布在东亚国家。尽管在食管癌的诊断和治疗上有很大的进展,但食管癌患者5-年生存率仅为15%至25%。最为显著的是,50%至60%的食管癌患者在诊断时即为晚期或具有转移。因此,寻找新的食管癌的分子靶点和开发新的治疗策略对于改善食管癌病人的预后具有十分重要的价值。重塑代谢途径是肿瘤细胞生理变化最为显著的特征之一,其中戊糖磷酸途径(pentose phosphate pathway,PPP)在脂质生成和核酸的合成中发挥重要的作用,并与多种不同肿瘤的发展和进展密切相关。转酮醇酶样基因1(transketolase-like 1,TKTL1)是一种关键的代谢调节酶,参与非氧化的PPP途径,提示其与许多肿瘤的发生发展关系密切。目前,三种人类的转酮醇酶基因包括TKT、TKTL1和TKTL2已经在人类基因组中被证实,但仅TKTL1是肿瘤中唯一上调的基因。进一步的研究发现,TKTL1与多种不同肿瘤的发生、发展和进展密切相关,包括膀胱癌、肺癌、子宫内膜癌和子宫颈癌。这些研究充分显示TKTL1在这些肿瘤中的重要价值,因而可能成为肿瘤潜在的分子治疗靶点。然而,迄今为止,TKTL1与食管鳞癌的关系尚未见报道,因此本研究的目的是检测TKTL1在食管鳞癌中的表达,初步阐明其在食管鳞癌中的潜在的生物学功能,该研究旨在为食管鳞癌的分子靶向治疗提供理论依据。第1章TKTL1在食管鳞癌组织中的表达及其与食管鳞癌病人预后的关系方法(1)采用免疫组织化学方法检测139例食管鳞癌组织和对应的正常食管上皮组织中TKTL1蛋白的表达。(2)采用Real-time qPCR和Western blot检测随机选取的8例食管鳞癌组织和对应的8例正常食管上皮组织中TKTL1 mRNA和蛋白的表达。(3)采用半定量RT-PCR分析不同临床分期食管鳞癌病人和不同转移状态的食管鳞癌病人中TKTL1 mRNA的相对表达水平。(4)利用SPSS17.0统计学软件分析TKTL1蛋白表达与食管鳞癌病人临床病理学参数之间的关系。(5)利用Kaplan-Meier(KM)生存曲线分析TKTL1蛋白的表达与食管鳞癌患者预后的关系。(6)数据的处理:用(x|-) ±s表示数据,将相关数据输入到SPSS 17.0软件中展开处理和分析。免疫组织化学的结果利用X2进行评估,Western blot、Real-time qPCR和半定量RT-PCR的结果采用One-way ANOVA分析,TKTL1蛋白的表达和食管鳞癌病人预后之间的关系采用Kaplan–Meier存活曲线分析。P<0.05表示差异具有统计学意义。结果(1)TKTL1在食管鳞癌组织中的阳性表达率为64.0%(89/139),显著高于正常食管上皮组织(11.5%,16/139),差异具有统计学意义(X2=81.556,P=0.000)。(2)随机选取的8例食管鳞癌组织中TKTL1 mRNA和蛋白的相对表达水平均显著高于正常食管上皮组织,差异具有统计学意义(P<0.05)。(3)TKTL1 mRNA在I+II期(0.496±0.034)中的相对表达量显著低于III+IV期的食管鳞癌病人(0.940±0.048),差异具有统计学意义(P<0.01)。(4)TKTL1 mRNA在有淋巴结转移组(1.015±0.056)中的表达显著高于无淋巴结转移组(0.557±0.033),差异具有统计学意义(P<0.01)。(5)TKTL1与食管鳞癌病人的性别和年龄无关(均P>0.05),但与食管鳞癌的组织学分化、临床分期和淋巴结转移密切相关(所有的P=0.000)。(6)Log-rank(Mantel-Cox)分析表明,具有阴性TKTL1的食管鳞癌病人的存活时间显著高于阳性的食管鳞癌病人(P<0.01)。第2章TKTL1表达下调对食管鳞癌细胞增殖、周期、凋亡和侵袭的影响及相关的分子机制方法(1)采用Western blot检测几株食管鳞癌细胞(Eca109、EC1和EC9706)和正常食管上皮细胞Het-1A中TKTL1蛋白的表达。(2)将TKTL1 siRNA转染食管鳞癌EC1细胞,于48h收获细胞,采用细胞裂解液提取总蛋白,采用Western blot检测转染TKTL1 siRNA后48h各个不同处理组中TKTL1蛋白的表达。(3)采用Real-time qPCR检测不同处理组别的食管鳞癌EC1细胞中TKTL1、TKT和TKTL2 mRNA的表达。(4)采用酶联方法检测不同处理的食管鳞癌EC1细胞的转酮醇酶活性。(5)采用CCK-8试剂测定不同时间点不同处理的食管鳞癌EC1细胞的增殖的情况。(6)利用流式细胞术检测3组不同处理的食管鳞癌EC1细胞周期及其所发生的变化。(7)流式细胞术检测不同处理的食管鳞癌EC1细胞凋亡(8)Boyden小室的主要作用是对接受各种处理的食管鳞癌EC1细胞在侵袭方面的表现进行检测,以更加准确地了解其侵袭能力的高低。(9)Caspase-3活性检测试剂盒用来检测不同处理的食管鳞癌EC1细胞中caspase-3的活性。(10)Western blot用来检测不同处理的食管鳞癌EC1细胞中cyclin D1、cdk4、Bcl-2、Bax、MMP-2和MMP-9的表达。(11)数据的处理:用(x|-) ±s表示数据,将相关数据输入到SPSS 17.0软件中展开分析,通过One-way ANOVA来处理数据,P<0.05代表具有统计学意义。结果(1)和健康食管上皮细胞Het-1A相比的,食管鳞癌细胞里面TKTL1蛋白的表达水平明显更高,组间对比结果具有显著性差异(P<0.05)。此外,TKTL1在EC1细胞中的表达又显著高于另外2株食管鳞癌细胞Eca109和EC9706,组间对比结果具有显著性差异(P<0.05)。(2)和空白对照组、对照siRNA转染组对比来看,TKTL1 siRNA组中TKTL1蛋白的表达显著下调,差异具有统计学意义(P<0.05)。(3)和空白对照组、对照siRNA转染组对比来看,TKTL1 siRNA组中TKTL1mRNA的表达显著下调(P<0.05),而TKT和TKTL2 mRNA的表达无变化(P>0.05)。(4)和空白对照组、对照siRNA转染组对比来看,TKTL1 siRNA组中的转酮醇酶的活性显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。(5)和空白对照组、对照siRNA转染组对比来看,TKTL1 siRNA转染后的24h、48h、72h和96h,食管鳞癌EC1细胞的增殖速度呈现出程度不一的降低,并且组间对比具有显著性差异(P<0.05)。(6)与空白对照组(52.57±1.22%)和对照siRNA转染组(52.97±2.49%)相比,TKTL1 siRNA组(63.83±0.96%)中G0/G1期的细胞数的比率大幅提高,组间对比具有显著性差异(F=42.566,P=0.000)。相反,TKTL1 siRNA组(24.23±1.29%)中S期的细胞数的比率显著低于未处理组(32.30±0.75%)和对照siRNA转染组(31.70±0.92%),差异具有统计学意义(F=59.145,P=0.000)。(7)与未处理组(7.39±0.68%)和对照siRNA转染组(7.67±0.67%)相比,TKTL1 siRNA组(17.65±1.41%)中EC1细胞早期凋亡率显著升高(F=106.897,P=0.000)。TKTL1 siRNA组(67.25±1.92%)中食管鳞癌EC1细胞的活细胞比率显著低于未处理组(88.22±1.39%)和siRNA对照组(87.33±1.31%)(F=172.627,P=0.000)。(8)与未处理组和对照siRNA转染组相比,TKTL1 siRNA组中caspase-3的活性显著升高,且差异具有统计学意义(P<0.05)。(9)与未处理组(115.67±11.68)和对照siRNA转染组(102.33±8.08)相比,TKTL1 siRNA组中EC1细胞的穿膜数(43.67±10.02)显著下降,且差异具有统计学意义(F=43.726,P=0.000)。(10)与未处理组和对照siRNA转染组相比,TKTL1 siRNA组中,无论是cyclin D1、CDK4、Bcl-2,还是MMP-2、MMP-9,其表达水平都有大幅的降低,但Bax蛋白的表达水平明显有所提高,且组间对比具有显著性差异(全部对比P<0.05)。第3章TKTL1表达下调对食管鳞癌裸鼠移植瘤生长的影响及初步机制方法(1)食管鳞癌EC1细胞(5×106)于皮下接种裸鼠,当肿瘤体积达100mm3时,裸鼠分为三组进行治疗:PBS治疗组、对照siRNA治疗组和TKTL1 siRNA治疗组,每周测量肿瘤体积2次,汇制肿瘤生长曲线,测量终止后测量肿瘤的重量。(2)Western blot用来检测不同治疗组中TKTL1、cyclin D1、CDK4、Bcl-2、Bax、MMP-2和MMP-9蛋白的水平。(3)免疫组织化学用来检测不同治疗组中Ki-67蛋白的表达,通过随机选取40个视野中Ki-67的阳性细胞数判定不同治疗组中增殖指数的变化。(4)统计学处理:数据以(x|-) ±s表示,采用SPSS17.0统计学软件进行分析,数据采用One-way ANOVA进行处理,P<0.05表示具有显著性差异。结果(1)与PBS治疗组和对照siRNA治疗组相比,TKTL1 siRNA治疗组中肿瘤的生长显著受到抑制,差异具有统计学意义(P<0.05)。(2)TKTL1 siRNA治疗组中肿瘤的重量(0.801±0.231)显著低于PBS治疗组(2.316±0.264)和对照siRNA治疗组(2.201±0.209),且差异具有统计学意义(F=63.915,P=0.000)。(3)TKTL1 siRNA治疗组中Ki-67的增殖指数为33.35±2.14%,显著低于PBS治疗组(76.44±5.62%)和对照siRNA治疗组(74.46±3.76%),且差异具有统计学意义(F=105.729,P=0.000)。(4)与PBS治疗组和对照siRNA治疗组相比,TKTL1 siRNA治疗组中TKTL1、cyclin D1、CDK4、Bcl-2、MMP-2和MMP-9的表达显著下调,而Bax蛋白的表达显著上调,且差异具有统计学意义(P<0.05)。结论(1)TKTL1在食管鳞癌中的高表达可能与食管鳞癌的发生、发展、进展和预后关系密切。(2)TKTL1表达下调降低转酮醇酶活性可能对食管鳞癌中PPP途径的功能产生最要的影响。(3)TKTL1表达下调体外抑制食管鳞癌细胞增殖、改变细胞周期分布、诱导凋亡和降低侵袭能力可能与cyclin D1、CDK4、Bcl-2、Bax、MMP-2和MMP-9蛋白表达的变化密切相关。(4)TKTL1 siRNA治疗显著抑制食管鳞癌裸鼠移植瘤的增殖可能与TKTL1、cyclin D1、CDK4、Bcl-2、Bax、MMP-2和MMP-9表达的表达密切相关。