目的:　　动脉粥样硬化是一种脂质代谢不平衡的慢性炎症性疾病。内皮细胞覆盖在血管壁表层，形成了一道防御动脉粥样硬化的天然屏障。当内皮细胞暴露于高血压、高血糖、高血脂等危险因素时会发生内皮功能障碍，降低内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)表达、增加炎性粘附分子产生、破坏细胞迁移能力。氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，oxLDL)作为血脂升高的关键成分，通过氧化应激诱导内皮功能障碍。E64d是木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶（如组织蛋白酶B，CTSB）的小分子抑制剂。因此，E64d涉及自噬溶酶体活动的调节。已有研究表明E64d对多种临床前期病理模型有效，如动脉粥样硬化、阿尔茨海默病、脑缺血、类风湿性关节炎和多发性骨髓瘤等。在大鼠脑缺血模型中，E64d能减弱神经血管内皮凋亡。E64d能够阻断细胞外弹性蛋白降解。弹性蛋白降解对动脉粥样硬化过程中的管壁重构十分重要。这些研究表明E64d可能具有保护内皮细胞、防止动脉粥样硬化的作用。然而目前E64d对内皮功能障碍的作用仍不清楚。因此，本实验要探究E64d对oxLDL诱导的人主动脉内皮细胞功能障碍的作用及潜在机制。　　方法:　　1.实验分组　　在oxLDL诱导内皮细胞损伤模型建立中，将人主动脉内皮细胞分为五组，分别用0、50、100、150、200mg/L oxLDL处理内皮细胞24小时，观察内皮细胞形态、活力、氧化应激、炎性粘附因子、eNOS蛋白表达和自噬水平的变化;在E64d干预氧化损伤内皮细胞实验中，先将人主动脉内皮细胞分为五组，分别以对照组、150mg/L oxLDL组、150mg/L oxLDL+1μM E64d组、150mg/L oxLDL+5μM E64d组、150mg/L oxLDL+10μM E64d组处理内皮细胞24小时，根据细胞活力检测结果选出E64d最佳干预浓度后，再将人主动脉内皮细胞分为三组，分别以对照组、150mg/L oxLDL组、150mg/L oxLDL+1μM E64d组处理内皮细胞24小时，检测内皮细胞凋亡、炎性粘附分子、eNOS蛋白表达和迁移能力的变化;在探讨E64d对自噬影响的实验中，将人主动脉内皮细胞分为三组，分别以对照组、150mg/L oxLDL组、150mg/L oxLDL+1μM E64d组处理内皮细胞24小时，检测内皮细胞中溶酶体组织蛋白酶B的表达、细胞自噬水平(LC3、p62、Beclin1的蛋白表达)、LC3荧光点、细胞超微结构和氧化应激水平的变化。　　2.CCK-8检测细胞活力　　CCK-8细胞增殖实验用于检测oxLDL和（或）E64d对细胞活力的影响。以适当密度将细胞均匀接种于96孔板中，37℃孵育12小时。用不同浓度的oxLDL(0mg/L，50mg/L，100mg/L，150mg/L，200mg/L)或150mg/L oxLDL以不同时间点(0h，6h，12h，24h，48h)或150mg/L oxLDL加不同浓度的E64d(1μM、5μM、10μM)处理人主动脉内皮细胞。加入10μL/孔CCK-8试剂，37℃孵育4小时后，用酶标仪在450nm波长处检测吸光度值。根据各组吸光度值与对照组的比值得出细胞活力。　　3.酶联免疫法(ELISA)检测细胞培养上清中的氧化应激标志(MDA、SOD)和炎性粘附分子标志(sICAM-1)　　不同浓度的oxLDL和（或）E64d处理细胞24小时后，收集培养上清。磷酸缓冲盐溶液(PBS)冲洗细胞，用胰蛋白酶消化细胞，收集细胞后离心再重悬。用细胞计数板计数各组细胞数。按照ELISA试剂盒中的说明检测各组培养上清中的MDA、SOD和sICAM-1浓度。　　4.划痕实验检测细胞迁移　　将细胞接种于6孔板，待细胞生长到单层融合时用10～20μL塑料枪头尖端划痕细胞，并在6孔板盖上作标记，光镜拍照。用培养基轻轻冲去细胞碎片，以对照组、150mg/L oxLDL组和150mg/L oxLDL+1μM E64d组37℃孵育细胞24小时。用光镜以6孔板盖上标记再次拍照，与不同时间点对比。划痕大小用Image-Pro Plus软件分析。　　5.AnnexinⅤ-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡　　收集对照组、150mg/L oxLDL组和150mg/L oxLDL+1μM E64d组37℃孵育24小时后各组的所有细胞，离心（2000转份，5分钟），洗涤细胞2次。加入5μL FITC混匀，再加入5μL PI混匀，于室温避光孵育5～15分钟，用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。　　6.免疫荧光检测自噬标记LC3点　　细胞在盖玻片上生长到70％融合时以对照组、150mg/L oxLDL组和150mg/L oxLDL+1μM E64d组37℃孵育细胞24小时。用PBS轻轻冲洗细胞，4％多聚甲醛固定30分钟。再次用PBS冲洗后，用含3％牛血清白蛋白(BSA)的PBS封闭15分钟。PBS冲洗细胞后，用PBS-3％BSA以1∶200稀释LC3一抗，4℃孵育过夜。荧光二抗染色后，细胞在室温下避光孵育30分钟。PBS冲洗后在共聚焦荧光显微镜下拍照观察。　　7.透射电子显微镜观察细胞超微结构　　将细胞接种于T75塑料培养皿，以对照组、150mg/L oxLDL组和150mg/L oxLDL+1μM E64d组37℃孵育细胞24小时。收集各组细胞，离心（1000转/分，10分钟，4℃），在4％戊二醛中4℃固定过夜，通过处理后用透射电镜观察。　　8.Western Blot检测内皮细胞中LC3、p62、Beclin1、eNOS和组织蛋白酶B(CTSB)的蛋白表达　　运用不同浓度oxLDL和（或）E64d处理内皮细胞24小时后，收集各组细胞。用BCA蛋白分析法进行蛋白浓度测定。取蛋白20μg上样于8％或15％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SD S-PAGE)进行电泳，转膜于PVD膜上。用5％脱脂奶粉封闭1小时后按照1∶1000稀释LC3，1∶1000稀释p62、1∶1500稀释Beclin1，1∶200稀释eNOS，1∶2000稀释CTSB，1∶800稀释β-actin一抗抗体，于4℃孵育过夜。取对应二抗室温孵育1小时后洗膜，用电化学发光法，将膜于成像系统中拍照。应用ImageJ软件分析电泳条带的灰度值。　　结果:　　1.oxLDL诱导内皮功能障碍、降低自噬流　　2.E64d减轻oxLDL诱导的内皮功能障碍　　3.E64d降低oxLDL诱导的自噬及氧化应激　　结论:　　E64d改善oxLDL诱导的与sICAM-1、eNOS、MDA、SOD、细胞活力、迁移能力相关的人主动脉内皮细胞功能障碍。E64d可能是通过抑制溶酶体组织蛋白酶B，降低oxLDL诱导的自噬水平，协同抗氧化应激起到保护氧化损伤的人主动脉内皮细胞作用。