气单胞菌（Aeromonas）是一种常见的条件致病菌,该属的不少菌株都被报道具有黑色素形成能力。大量研究发现黑色素是致病菌的毒力因子之一,但气单胞菌的黑色素代谢基因及作用机理却鲜见报道。中间气单胞菌（A.media）WS菌株是实验室前期自武汉东湖分离得到的一株高产黑色素菌株。前期工作发现,在该菌的培养液上清中可检测到L-多巴（L-DOPA）的存在,暗示其可通过酪氨酸酶途径合成多巴黑色素;但奇怪的是该菌的酪氨酸酶活性只有通过活性染色（native-PAGE）的方法才能检测到,通过蛋白质N端测序结合Adaptor PCR方法克隆到的一个酪氨酸酶编码基因（melA）在大肠杆菌中进行异源表达时也未能使宿主细胞形成产黑表型。为了弄清前期克隆的melA是否确实是WS菌株的黑色素形成关键基因,本研究首先对酪氨酸酶基因的大肠杆菌表达体系进行了研究,结果发现无论是单基因作用的蜡状芽胞杆菌（Bacillus cereus）来源酪氨酸酶,还是以操纵子行使功能的链霉菌来源酪氨酸酶MeIC均能在pET载体系统中高效表达,使大肠杆菌BL21（DE3）产黑;其His-tag标签的纯化产物也能检测到明显的酪氨酸酶酶活,且在以L-DOPA为底物的非变性蛋白胶上检测到活性条带;而WS菌株来源的TyrA（melA的编码产物）却在以上检测体系中均显示阴性,不能使宿主细胞获得变黑表型。再进一步采用大引物PCR的方法对TyrA上被认为是酪氨酸酶活性中心的六个组氨酸位点进行定点突变,构建了系列His（x）Asn突变株。对突变株进行酪氨酸酶活性测定,结果发现所有突变株的酶活性与原始酶相比并没有显著差异。最后,我们以氨苄青霉素作为WS菌株的抗性筛选标签,采用pDM4自杀质粒系统对WS菌株染色体上的melA进行了敲除,但得到的敲除突变株WS △melA的黑色素形成能力和野生菌株相比并无明显改变,进行native-PAGE活性染色时突变株和野生菌株的相应活性染色条带也无任何改变。上述结果表明,我们前期克隆的melA并不是WS菌株中控制黑色素合成的关键基因,其编码产物甚至可能并非酪氨酸酶。在采用鸟枪法克隆WS菌株黑色素合成基因始终未获成功、通过构建转座子插入突变文库鉴定色素形成关键基因也遇到诸多困难的情况下,我们对WS菌株进行了全基因组测序,以期获得有用的黑色素合成相关数据资源。采用Solexa末端双向测序方法完成了 WS菌株基因组的草图测序,并在此基础上进一步采用ABI 3730xL测序仪、Roche 454GS FLX及Pacbio RS Ⅱ测序系统相结合的优化方案完成了其完成图的测序。基因组分析结果发现,该基因组由一个4,777,154 bp的染色体和一个大小为11,276 bp的环形质粒pWSY组成,共线性分析结果发现该基因组与嗜水气单胞菌的基因组相比存在较多的重排插入现象。通过pfam00264结构域扫描方法对多巴黑色素合成通路进行了分析,没有发现典型酪氨酸酶编码基因的存在,但多酚氧化酶结构域扫描的结果中检测到了一个漆酶（Laccase）类似编码基因yfiH;同时还找到了一些与细菌脓黑色素合成相关的尿黑酸（Homogentisate,HGA）代谢的一些主要基因。而此前包括本实验室在内的研究者从未在气单胞菌培养物中检测到HGA的存在,且这些HGA相关基因在产黑和不产黑的气单胞菌中均普遍存在。此外,通过WEGO工具的GO功能进行分类分析,预测到WS菌株基因组上有305个基因参与色素形成过程,包括一些DNA与RNA的调控层面及蛋白代谢方面的编码基因,它们在已报道的铜绿假单胞菌P14菌株黑色素突变文库中也被发现;此外,这些基因中有64个预测是与环境应答相关蛋白的编码基因,暗示着黑色素合成是WS菌株对环境适应性的表现。对WS菌株培养过程中的中间代谢产物用高效液相色谱技术（HPLC）再次进行了系统分析,结果在一些特定时期的培养物中检测到了 HGA的存在,并由实验室另一位同学证实该菌的黑色素主要是通过HGA途径合成的脓黑色素,相关基因的缺失会导致细胞在LB培养基发酵时几乎完全失去产黑能力。但有意思的是,在该菌的培养液中始终可检测到L-DOPA的存在。为了了解WS菌株在形成脓黑色素的同时是否也可以形成多巴黑色素,我们采用红外光谱（IR）、毛细管电泳（CE）及电喷雾质谱（ESI-MS）对该菌的黑色素进行了检测,结果显示该菌株的黑色素组分中存在多巴黑色素的基本单元5,6-二羟基吲哚,说明该菌可以合成由脓黑色素和多巴黑色素组成的混合色素。对该菌株的细胞总蛋白进行native-PAGE活性染色,可以观察到两条活性染色带,说明该菌可能存在两个具有催化多巴合成黑色素能力的多酚氧化酶。由于基因组分析中得到的漆酶YfiH属于多酚氧化酶,首先我们对其编码基因yfiH进行敲除,结果发现以多巴为底物的活性染色条带其中之一消失,说明YfiH是两个多酚氧化酶之一（命名为PPO1）。进一步采用液质联用蛋白质质谱技术结合WS菌株基因组数据库对另一个多酚氧化酶进行鉴定,在获得的55个质谱结果中我们通过信息学分析推测其中标注为过氧化氢酶（Catalase,CAT）的蛋白可能具有多酚氧化酶活性。对CAT缺失株WSAkatE进行活性染色发现,另一条活性条带也消失,说明katE编码蛋白是WS菌株中的另一个多酚氧化酶活性蛋白（命名为PP02）。对双重突变株WS△yfiH △katE的活性染色检测发现相应的两条多酚氧化酶条带均消失不见,进一步证实了上述结果。漆酶表现多酚氧化酶活性的现象已经在生物界被普遍证实,但原核来源过氧化氢酶表现出多酚氧化酶活性的现象尚未见报道。首先,我们对推测的CAT进行了过氧化氢酶功能（CAT活力）的进一步验证。通过试剂盒检测发现,WS野生菌株胞内液的CAT活性明显（约为3.68U/mL）;而突变株WSAkatE无论在胞内还是胞外均无法检测到CAT活性,这说明推测的CAT是过氧化氢酶蛋白,这与信息学上KatE结构域的预测结果一致。具有KatE结构域的过氧化氢酶在其他细菌中也存在,比如大肠杆菌BL21（DE3）中的过氧化氢酶其中之一中的Hpii蛋白。采用λ噬菌体的Red重组系统对其编码基因hpii进行缺失,细胞的过氧化氢酶活性降低到野生菌株的20%。由于Hpii与CAT的氨基酸同源性达到47%,因此它可能也存在双重活性。进一步对CAT和Hpii都进行了异源表达,两者的纯化产物检测结果显示均表现出过氧化氢酶和多酚氧化酶双重活性,可见WS菌株中CAT的多重酶学活性现象可能是细菌演变过程中的一种普遍进化策略。在确定了活性染色法观察到的WS菌株二个多酚氧化酶（PPO1和PP02）的基础上,我们对两者与该菌黑色素合成的相关性进行了研究。对YfiH（即PPO1）缺失株WS△yfiH的检测发现,该菌的黑色素合成能力和野生菌株相比并无明显变化（约10%的下降）,说明YfiH与WS菌株的色素形成关系不大。而CAT（即PPO2）缺失株WS △katE的黑色素合成不仅在产量上大幅度下降（超过50%）,其合成过程相对于WS野生菌株而言也大幅度提前（从24 h提前至15 h）,这与已经证明的WS菌株以尿黑酸通路为该菌黑色素合成主要途径的结论并不完全相符。由此我们推测细菌黑色素的合成会受到胞内氧自由基（ROS）水平的调节。胞内ROS的检测结果发现,WS野生菌株在黑色素合成过程中胞内ROS水平会上升,最终值大约是黑色素合成前的6.5倍（以ROS-B表示）;而WS AkatE突变株在黑色素合成前一时刻,胞内ROS水平由于CAT的缺失而失调,其值略高于ROS-B,但在黑色素合成后则会下降至与ROS-B相当的水平。黑色素具有清除氧自由基的能力,在面对胞内氧自由基压力的时候可以部分行使CAT相关酶类的功能,因此突变株WS AkatE的黑色素合成过程被提前以维持胞内的ROS水平的上限,这个现象与真核生物中的相关报道一致。同时,由于在对黑色素的研究报道中显示黑色素合成过程也会产生一定的氧自由基,因此突变株WS△katE在通过细胞组分上黑色素对氧自由基清除的同时,在胞外黑色素水平方面也会相对减少以维持胞内ROS水平。由此可见,胞内ROS水平的压力是突变株WS△katE黑色素合成过程提前的原因,而ROS的最终平衡也是突变株胞外黑色素产量下降的原因之一。采用pBBR1MCS-5-katE回补质粒对突变株WS△katE进行了回补,结果显示回补菌株在native-PAGE活性染色条带及黑色素合成表型方面均得到了回复。综上,本文通过对中间气单胞菌WS菌株全基因组的测序分析以及在生物学上对该菌株黑色素合成调控的研究,将为进一步揭示气单胞菌黑色素的合成机理及生物学功能奠定理论和技术基础,也可为研究黑色素与生物对环境的适应性进化提供一定的参考基础。