论文部分内容阅读
目的:急性缺血性脑卒中（Acute ischemia stroke,AIS）是最常见的急性脑血管疾病,具有高发病率、高致死率和高致残率的特点。目前AIS的临床治疗药物十分有限,而且其疗效及预后受多种不利因素如高血压、高血脂和高血糖等危险因素的影响,因此探寻创新的治疗策略或干预模式研究,以寻求切实有效的治疗药物具有重大意义。内皮祖细胞（Endothelial Progenitor Cells,EPCs）作为参与出生后血管新生和内皮损伤后修复的主要参与者,因而以EPCs作为治疗靶点,促进缺血损伤区域的神经血管网络重建,将可能成为理想的治疗卒中的策略。当归补血汤（Danggui Buxue Tang,DBT）作为常用的益气活血类经典方剂,研究结果表明DBT具有较好的促血管新生作用,且对脑缺血损伤具有一定的保护作用。但是对于脑缺血过程中的血管损伤修复作用,尤其在高脂、高糖等不利微环境下,DBT是否能通过以EPCs为靶点,促进损伤血管的修复,发挥改善缺血性脑损伤的作用,目前尚未见报道。本论文通过体内外实验,观察当归补血汤对急性脑缺血损伤的保护作用,以及在异常血脂条件下的促血管新生作用及可能的分子机制。方法:实验一:当归补血汤对MCAO模型小鼠的保护作用及机制选择体重26-30g的雄性C57BL/6J小鼠,参考Koizumi法建立大脑中动脉栓塞（Middle cerebral artery occlusion,MCAO）小鼠模型。实验共分 3 组,包括假手术组（Sham）、模型组（MCAO）和当归补血汤治疗组（DBT）,每组12-15只小鼠。取材前,各实验组小鼠给予相应药物灌胃,2次/天,其中DBT组小鼠给予6g/kg的当归补血汤治疗,而Sham组和MCAO组小鼠则给予等体积的生理盐水灌胃处理。术后24h取脑组织,采用TTC染色法观察大脑梗死灶的大小;术后第1天、第3天和第5天对小鼠进行神经功能评分;术后第5天将小鼠处死,分离大脑组织,分别进行冰冻组织切片和提取蛋白质检测相关蛋白的表达。分别采用尼氏染色和Western Blot法检测脑组织Bcl-2、Bax蛋白的表达,观察神经元的损伤与细胞凋亡;采用免疫荧光法检测CD31和vWF的表达,观察缺血区域的微血管密度;采用CD133、CD34和VEGFR2细胞表面抗原标记脑缺血区域的EPCs数量,观察EPCs的归巢;Western Blot法检测脑组织PERK、IRE-1α、eif-1 α和CHOP蛋白的表达,免疫荧光法观察CD31与CHOP共表达,观察血管内皮细胞的内质网应激;Western Blot法检测脑组织SQSTM1/P62、LC3蛋白的表达,免疫荧光法观察CD31与LC3的共表达,观察血管内皮细胞的自噬。实验二:当归补血汤对高脂合并MCAO模型小鼠的保护作用及机制选择4周龄雄性C57BL/6J小鼠,以高脂饲料（High fat diet,HFD）持续喂养12周,建立高脂血症小鼠模型,并参考Koizumi法建立MCAO小鼠模型。实验共分3组,包括假手术组（Sham）、高脂合并脑缺血模型组（HFD-MCAO）和当归补血汤治疗组（DBT）,每组12-15只小鼠。取材前,各实验组小鼠给予相应药物灌胃,2次/天,其中HFD-DBT组小鼠给予6g/kg的当归补血汤治疗,而Sham组和HFD-MCAO组小鼠则给予等体积的生理盐水灌胃处理。术后24h取脑组织,采用TTC染色法观察大脑梗死灶的大小;术后第5天将小鼠处死,分离大脑组织,分别进行冰冻组织切片和提取蛋白质检测相关蛋白的表达。分别采用尼氏染色和Western Blot法检测脑组织Bcl-2、Bax蛋白的表达,观察神经元的损伤与细胞凋亡;采用免疫荧光法检测CD31和vWF的表达,观察缺血区域的微血管密度;采用CD133、CD34和VEGFR2细胞表面抗原标记脑缺血区域的EPCs数量,观察EPCs的归巢;Western Blot法检测脑组织PERK、IRE-1 α、eif-1 α和CHOP蛋白的表达,免疫荧光法观察CD31与CHOP共表达,观察血管内皮细胞的内质网应激;Western Blot法检测脑组织SQSTM1/P62、LC3蛋白的表达,免疫荧光法观察CD31与LC3的共表达,观察血管内皮细胞的自噬。实验三:DBT对H202诱导损伤的EPCs的保护作用及机制以体外培养的小鼠骨髓来源EPCs为研究对象,采用400 μ M的H202处理进行诱导损伤,并分别给予100 μg/ml、200 μ g/ml、400 μg/ml的DBT水取物进行干预。采用MTT法检测细胞活力;采用Transwell实验检测细胞迁移;采用Tube formation实验检测体外血管形成;采用DHE荧光探针检测胞内ROS的浓度,Western Blot法检测Bcl-2、Bax蛋白的表达,观察氧化应激损伤及细胞凋亡;Western Blot法检测PERK、IRE-1α、eif-1 α和CHOP蛋白的表达,观察细胞的内质网应激;Western Blot法检测SQSTM1/P62、LC3蛋白的表达,观察细胞的自噬。实验四:DBT对H202诱导损伤的EPCs的保护作用及机制以体外培养的小鼠骨髓来源EPCs为研究对象,采用90 μ g/ml的ox-LDL处理进行诱导损伤,并分别给予100 μg/ml、200 μg/ml、400 μ g/ml的DBT水取物进行干预。采用MTT法检测细胞活力;采用Transwell实验检测细胞迁移。采用Western Blot法检测Bcl-2、Bax蛋白的表达观察细胞凋亡;检测SQSTM1/P62、LC3蛋白的表达观察细胞的自噬;检测PERK、IRE-1α、eif-1α和CHOP蛋白的表达观察细胞的内质网应激。结果:实验一:采用MCAO模型小鼠观察DBT对脑缺血损伤的保护及促血管新生作用。结果显示,在缺血损伤保护方面,与MCAO模型组小鼠比较,给予6g/kg的DBT治疗后,小鼠可一定程度降低术后第1天、第3天和第5天的Bederson神经功能评分;DBT可显著减少缺血侧大脑梗死灶体积（P<0.01）;DBT可明显减少脑缺血区域的受损伤神经元数目,显著增加缺血脑组织中Bcl-2蛋白的表达（P<0.01）。在促血管新生方面,与MCAO组小鼠比较,DBT组小鼠损伤侧大脑中EPCs明显增加;脑组织中vWF、CD31阳性表达的细胞数也明显增加。在分子机制层面,与MCAO组比较,DBT治疗后小鼠脑组织CD31+标记的血管内皮细胞中的CHOP蛋白的表达明显减少,脑组织中PERK、IRE1α、eif2 α和CHOP蛋白的表达显著减少（P<0.01）;DBT治疗组小鼠脑组织中SQSTM1/P62蛋白的表达显著减少（P<0.01）,而LC3-Ⅱ型蛋白的表达显著增加（P<0.01）。实验二:采用高脂血症小鼠建立脑缺血模型（HFD-MCAO）,实验结果表明,在缺血损伤保护方面,与HFD-MCAO组小鼠比较,DBT可减少缺血侧大脑梗死灶体积;DBT可明显增加脑缺血区域的尼氏阳性染色神经元数目,显著增加脑组织中Bcl-2蛋白的表达（P<0.01）,显著减少Bax蛋白的表达（P<0.01）。在促血管新生方面,与HFD-MCAO组小鼠比较,DBT组小鼠损伤侧大脑中EPCs显著增加;脑组织中vWF、CD31 阳性表达的细胞数也显著增加。在分子机制层面,与HFD-MCAO组小鼠比较,DBT治疗后小鼠脑组织CD31+标记的血管内皮细胞中的CHOP与IRE1 α蛋白的表达显著减少,脑组织中PERK、IRE1 α、eif2α和CHOP蛋白的表达显著减少;DBT治疗组小鼠脑组织中SQSTM1/P62蛋白的表达显著减少,而LC3-Ⅱ型蛋白的表达显著增加。实验三:采用H202体外诱导建立自由基氧化损伤模型,实验结果表明,DBT可明显改善H202诱导引起的EPCs细胞活力、迁移能力和体外成小管功能的下降。进一步研究发现,DBT可明显抑制H202引起的胞内ROS的水平,并显著增加Bcl-2蛋白的表达（P<0.01）,显著减少Bax蛋白的表达（P<0.01）的表达。与H202处理组比较,DBT组EPCs细胞中的PERK、IRE1α、eif2 α和CHOP蛋白的表达显著减少（P<0.01）。与H202组比较,给予DBT治疗后细胞SQSTM1/P62蛋白的表达显著减少（P<0.01）,而LC3-Ⅱ型蛋白的表达显著增加（P<0.01）。实验四:采用ox-LDL体外诱导建立脂质氧化损伤模型,实验结果表明,DBT对ox-LDL诱导损伤的EPCs的细胞活力没有显著的改善作用。DBT可改善ox-LDL诱导损伤后EPCs的迁移能力。与ox-LDL组比较,DBT可显著增加Bcl-2蛋白的表达（P<0.01）,减少Bax蛋白的表达（P<0.01）。与ox-LDL组比较,给予DBT治疗后,PERK、IRE1 α、eif2 α和CHOP蛋白的表达显著减少（P<0.01）。与ox-LDL组比较,给予DBT治疗后,SQSTM1/P62蛋白的表达显著减少,而LC3-Ⅱ型蛋白的表达显著增加（P<0.01）。结论:1.在一般及血脂异常条件下,DBT均可通过增加EPCs的归巢,促进缺血损伤区域的血管新生,具有改善脑缺血再灌注损伤的作用。2.DBT可抑制氧自由基或异常脂质对EPCs的细胞增殖、迁移及体外血管形成等生物学功能的损伤,并抑制ROS的形成及细胞凋亡。3.在脑缺血损伤过程中,DBT的促血管新生作用可能与其促进细胞的自噬,抑制内质网应激有关。综上所述,当归补血汤可通过激活细胞自噬,抑制内质网应激,发挥对抗氧自由基或异常脂质引起的EPCs的生物学功能损伤,增加EPCs的归巢,促进缺血损伤区域的血管新生,发挥抗脑缺血损伤的作用。