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意大利地中海水牛因其高产奶量和优良的奶质被公认为是目前世界上河流型水牛中乳用性能最好的品种之一。广西于2014年引进该品种水牛,受冷冻保存配方、冷冻程序和个体差异等因素影响,目前的种公牛精液冷冻保存效果不甚理想,这极大地影响了地中海水牛的繁殖效率。因此,探讨抗氧化剂等对精液冷冻保存效果的影响,研发针对意大利地中海水牛的精液稀释液配方,对提高种公牛利用率有着重大意义。为此,本研究在传统精液稀释液基础上,首先重新比较有效成分、调整其比例、同时引入新的保护剂、拟出新配方,随后应用改进的配方探讨添加褪黑素、谷胱甘肽和维生素E等不同抗氧化剂对地中海水牛精液冷冻保存的效果影响。研究结果如下。1.地中海水牛精液冷冻稀释液配方的改进研究在水牛精液常用冷冻稀释液的基础上,首先对配方中的能量物质、抗冻物质和抗菌物质分别进行效果比较。结果发现,稀释液成分中卵黄的冷冻保存效果优于鲜全奶;3%甘油和2%乙二醇联合作用效果优于5%的甘油、5%的乙二醇和5%的DMSO三者单独作用时的效果;青霉素和庆大霉素的抑菌效果比较明显;其次,对于新引入的保护剂牛血清白蛋白(BSA),和未添加组相比,0.9 mg/mL的BSA显著提高了水牛精子的活率,降低其畸形率(P<0.05);改进后的地中海水牛精液稀释液配方为:0.10 g/mL葡萄糖、0.0006 g/mL柠檬酸钠、0.0011 g/mL青霉素、0.0006 g/mL庆大霉素、0.9 mg/mLBSA、3%甘油、2%乙二醇、20%卵黄、75%蒸馏水。2.褪黑素、谷胱甘肽和维生素E对地中海水牛精液冷冻保存效果的影响在冷冻稀释液中添加褪黑素(MLT)时发现,添加0.Img/mLMLT显著提高了受精卵分裂率和GSH-Px酶活性(P<0.05),对精子活率、畸形率、运动性能等变化无显著差异(P>0.05);添加0.2mg/mL、0.4mg/mL MLT明显提高了冻后精子活率、顶体完整率、GSH-Px酶活性、受精卵分裂率和囊胚率(P<0.05),添加0.2mg/mLMLT还显著降低了精子畸形率(P<0.05)。添加0.8mg/mLMLT明显降低了精子活率(P<0.05),对精子运动性能、受精卵分裂率、囊胚率等均没有显著影响(P>0.05)。添加谷胱甘肽(GSH)处理时发现,添加0.1mMGSH显著提高精子前向性和质膜完整率,降低了精子畸形率(P<0.05),对精子活率和顶体完整率无明显影响(P>0.05)。添加0.2 mMGSH明显了提高精子活率、运动性能、质膜完整率、GSH-Px酶活性和囊胚率(P<0.05),显著降低精子畸形率和MDA水平(P<0.05)。0.4mMGSH增加了精子畸形率,显著提高GSH-Px酶活性、受精率分裂率、囊胚孵化率(P<0.05),对顶体完整率、SOD酶活性等无明显影响(P>0.05)。添加0.8 mMGSH增加了精子畸形率(P<0.05),对精子抗氧化物酶活性和囊胚率等无显著性影响(P>0.05)。添加维生素E(VE)处理时发现,与未添加组相比,0.1 mg/mL和0.2 mg/mLVE对精子活率无明显影响(P>0.05)。0.2mg/mL、0.4mg/mLVE明显提高精子的GSH-Px酶活性、顶体完整率、质膜完整率、受精卵分裂率、囊胚率和囊胚孵化率,显著降低了精子MDA水平(P<0.05)。0.4mg/mL、0.8mg/mLVE显著提高了精子活率(P<0.05),其中0.4mg/mL时精子活率最大,0.4mg/mL VE显著降低了精子畸形率,0.8mg/mLVE导致畸形率增加(P<0.05),0.8mg/mLVE明显提高受精卵分裂率(P<0.05),对囊胚率和囊胚孵化率无显著影响(P>0.05)。3.三种抗氧化剂配伍作用对地中海水牛精液冷冻保存效果的影响为了解两种或多种抗氧化剂配伍添加的协同效果,根据单独添加MLT、GSH和VE时的作用效果确定各抗氧化剂的配伍浓度,分别为MLT(0.2 mg/mL、0.4 mg/mL)、GSH(0.1 mM、0.2 mM)、VE(0.2 mg/mL、0.4 mg/mL),将其两两组合,共形成12个配伍组合。结果发现,与未添加组相比,0.2 mg/mL VE+O.1 mM GSH、0.4 mg/mL VE+0.2 mg/mL MLT、0.2 mg/mL MLT+0.1 mM GSH组合均能在一定程度上提高了精子活率,降低精子畸形率,其中 0.2 mg/mL MLT+0.1 mM GSH 和 0.4 mg/mL VE+0.2 mg/mL MLT 表现较突出。三个配伍组合均显著提高了精子运动性能、顶体完整率和质膜完整率(P<0.05),其中尤以0.2mg/mLMLT+0.ImMGSH组合提升效果最好。三个配伍组合均显著提高了受精卵分裂率(P<0.05),0.4 mg/mL VE+0.2 mg/mL MLT和 0.2 mg/mL MLT+0.1 mM GSH组合对囊胚率的提高有显著差异(P<0.05),0.4 mg/mL VE+0.2 mg/mL MLT和0.2 mg/mL VE+0.1 mM GSH显著提高了囊胚孵化率(P<0.05)。综合考虑,0.2 mg/mL MLT+0.1 mM GSH 和 0.4 mg/mL VE+0.2 mg/mL MLT 组合优于 0.2 mg/mL VE+0.1 mM GSH。以上结果表明,添加 0.2 mg/mL MLT、0.2 mM GSH 或 0.04 mg/mL VE可提高水牛精液的冷冻保存效果较好,采用0.4mg/mLVE+0.2mg/mL MLT或0.2 mg/mL MLT+0.1 mM GSH的组合添加剂对地中海水牛精液冷冻保存可取得较好效果。