基因定点编辑技术为植物功能基因研究和作物遗传育种提供了重要的技术支撑。CRISPR/Cas9基因编辑系统作为当前最热门的基因编辑技术,其作用原理主要由sgRNA靶向目的DNA序列并与之结合,从而激活Cas9的核酸酶切割靶DNA,产生靶序列DNA双链断裂(DSB)的损伤。通过非同源末端连接与同源重组的修复方式在靶位点处产生DNA片段的插入或缺失或在靶位点处敲入外源片段或引入点突变,以此来实现对目的基因的突变。另外,在DNA修复机制中,同源重组的效率远远低于非同源末端连接,导致靶位点处修复结果不可控。而单碱基编辑技术在不依赖双链断裂的条件下实现对目标基因片段中特定位点的单个碱基进行转换,可以实现目标基因的精确修饰。目前已开发出实现靶序列中C/G→T/A转换的CBE编辑器和A/T→G/C转换的ABE编辑器,这些单碱基编辑器针对目标基因的修饰可以不再依赖于DNA双链断裂且能产生4种形式的碱基转换,既规避了HR修复途径效率低的限制,也摆脱了NHEJ修复途径的随机性。植物的成花过程受外部环境的影响与错综复杂的内源基因调控。FT、CO调控植物开花进程,突变FT、CO基因使其在植物体内的表达量降低或不表达将促使植物晚开花。甘蓝持绿基因HG与拟南芥NYC1基因高度同源,参与植物叶绿素代谢途径,突变HG可使植物的叶片衰老过程减缓,长时间的保持绿色,极大的延缓了植物衰老进程,提高其品质。突变BoFT、BoCO、BoHG基因使甘蓝叶球长时间保持绿色且不会裂球开花,既保持了甘蓝的商品价值,也在一定程度上延长甘蓝的供货期,从而提高了结球甘蓝的生产效率。本试验以烟草与甘蓝为研究对象,对甘蓝BoFT和BoCO基因进行敲除,获得晚花耐抽薹甘蓝材料;利用CRISPR/Cas9、ABE技术,编辑烟草PDS基因,初步在烟草中验证实验中所用ABE编辑器对植物基因编辑的有效性;在甘蓝中针对甘蓝调控开花与持绿相关的基因Bo FT、Bo CO以及Bo HG进行编辑,以期获得综合性状优良稳定的持绿耐抽薹甘蓝品种。本研究获得的结果如下:1.CRISPR/Cas9系统对甘蓝BoFT、Bo CO基因的编辑。针对FT、CO两个与抽薹开花时间高度相关的双基因编辑载体pCas-t Bo FT-ABC/tBo CO-ABCD,利用农杆菌介导法转化甘蓝自交不亲和系F416,获得p Cas-t Bo FT-ABC/t Bo CO-ABCD转基因植株21株(来源于一个愈伤),对21个单株进行检测,Bo FT基因3个突变位点中仅一个位点产生突变(C位点),突变效率100%。Bo CO基因4个位点中B、C位点产生突变,且C位点的突变均为大片段缺失,突变效率为100%。通过随机选取8株突变材料对FT、CO基因单克隆测序的结果分析发现,Bo FT基因C位点突变频率58.75%,BoCO基因B、C位点的突变频率分别为78.08%和10.96%。以野生型自交不亲和系F416为对照,突变体植株株型无明显变化,但花器官的发育出现异常,柱头、雄蕊等发育畸形,双杂合突变植株花期较野生型对照无明显差异,双基因纯合突变植株花期明显晚于野生型对照,单纯合突变植株花期介于两者之间。通过蕾期自交实验发现,突变材料难以自交产生种子,其原因有待进一步研究。2.ABE编辑器对烟草PDS基因以及甘蓝BoFT、Bo CO以及Bo HG的编辑。构建以Bar基因与MYB红色标记基因为筛选标记的p Cas-t Nt PDS-ABCD敲除载体、p ABE-t Nt PDS-ABCD单碱基编辑载体。利用农杆菌介导法分别转化烟草,通过pCas-t Nt PDS-ABCD烟草敲除植株作为对照,对转基因烟草靶位点突变进行检测发现,ABE编辑器能有效的识别靶位点并在活性窗口内实现A/T→G/C转换,显示所构建的ABE编辑载体在烟草中能实现有效的单碱基编辑。但相对pCas-t Nt PDS-ABCD烟草敲除植株出现明显的白化苗,p ABE-t Nt PDS-ABCD单碱基编辑载体转基因植株中未发现明显的白化苗现象。构建以Bar基因和MYB红色标记基因为筛选标记的表达载体p ABE-Bar MYB-t Bo FT-A/tBo CO-A/t Bo HG-AB,针对甘蓝调控开花与持绿相关的基因BoFT、Bo CO以及Bo HG的内含子与外显子连接处的A/T碱基进行编辑。利用农杆菌介导法转化甘蓝自交不亲和系F416,对获得的转基因植株进行PCR测序,结果表明,通过ABE编辑方法成功的在甘蓝中对Bo FT和Bo HG实现了指定窗口的单碱基转换,其中BoFT靶位点转换率为7.69%,Bo HG的突变效率为76.92%。随机选取2株突变材料对BOHG基因进行单克隆测序,结果显示BoHG基因在靶位置A处突变频率为23.53%,B位置的突变频率为100%。