论文部分内容阅读
由尖孢镰刀菌香蕉专化型（Fusarium oxysporum f.sp.cubense,Foc）侵染引起的香蕉土传枯萎病已成为全球香蕉种植产业面临的主要问题。利用生防菌进行生物防治是防控香蕉枯萎病的重要途径。本论文以香蕉枯萎病原菌4号生理小种（Foc4）为靶标菌,对五指山药用植物内生放线菌进行了分离鉴定及抗菌活性筛选,优化了具有高拮抗活性链霉菌5-4的发酵条件,研究了链霉菌5-4的抑菌机理及对香蕉枯萎病的防治效果。该研究将为链霉菌5-4的研发和应用奠定基础,为绿色防治香蕉枯萎病提供参考。具体研究结果如下:1.以海南省五指山自然保护区的35种药用植物为试验材料,共分离到144株内生放线菌。其中43株内生放线菌对香蕉枯萎病菌具有抑菌活性,且大多数属于链霉菌属（Streptomyces）,尤其是放线菌5-4和5-10表现出较强的抑菌活性。通过形态特征观察、生理生化特性测定和16S r DNA的分类鉴定,表明放线菌5-4属于吸水链霉菌吸水亚种（Streptomyces hygroscopicus subsp.hygroscopicus）,放线菌5-10归属于链霉菌属。2.通过响应面优化法得到试验模型:Y=87.29-1.52X1+7.99X2+3.16X3+2.52X1X2+3.55X1X3+1.97X2X3-14.36X1~2-12.74X2~2-5.32X3~2。最终确定链霉菌5-4的最优发酵培养条件为:可溶性淀粉21.512 g/L,黄豆粉15 g/L,酵母粉5 g/L,蛋白胨2 g/L,Ca CO34 g/L,Na Cl 4.734 g/L,p H 7.0,接种量为3.217%,并预测其最大抑菌率为89.24%。验证试验表明通过响应面法优化发酵条件后,其抑菌率达到了88.36%,比优化前（54.96%）提高了33.4%,且与预测值相差不大,说明优化后的发酵培养基更有利于发酵粗提物活性物质的生成。3.链霉菌5-4具有广谱抗真菌活性,对6个属的13种靶标菌都表现出较好的拮抗作用。链霉菌5-4粗提物能够抑制Foc4病菌孢子的萌发,使其菌丝出现明显的肿大、皱缩、干瘪和断裂,且其细胞的细胞壁出现不规则加厚,呈多层细胞壁,细胞器大多破损水解,出现明显的空泡化。链霉菌5-4粗提物处理后的Foc4病菌随着用药浓度和时间增加,其胞外还原性糖和丙二醛的含量越高,而可溶性蛋白含量和NADH氧化酶的活性则显著降低,表明了链霉菌5-4粗提物使Foc4病菌的细胞膜出现了氧化损伤,导致病菌胞外调节能力降低以及物质代谢等生理功能絮乱的病变。链霉菌5-4粗提物还能够水解几丁质和β-1,3-葡聚糖,破坏Foc4病菌的细胞壁,从而抑制了菌体的正常生长。表明了链霉菌5-4粗提物能够影响菌丝体、孢子等的正常生长发育,使香蕉镰刀菌难以维持正常的生理过程,因此,链霉菌5-4粗提物对Foc4病菌具有毒杀或者抑制的作用。4.链霉菌5-4的盆栽防效试验表明,只接种Foc4的处理,其发病率高达74.07%,且球茎出现明显的黑化现象,通过激光共聚焦扫描显微镜发现有大量的GFP-Foc4菌丝体和分生孢子存在于香蕉根部,表明了GFP-Foc4病菌能迅速在香蕉根中定殖,侵染并导致其发病。施加链霉菌5-4的处理防治效果达到71.36%,其香蕉根系仅有少量GFP-Foc4附着。说明了链霉菌5-4能抑制病原菌侵染香蕉根系。在盆栽试验研究中还发现,施加链霉菌5-4的香蕉苗株高、茎粗、叶面积、生物量等指标均比对照组（H2O处理、Foc4处理）高,表明了链霉菌5-4具有促进植物生长的作用。5.链霉菌5-4的基因组总长度为9,929,690 bp,（G+C）mol%含量为72.094%,其中COG功能注释显示有280个基因参与了次生代谢产物的合成、转运和代谢,占注释到的总基因数的4.38%。KEGG富集分析显示基因涉及最多的通路主要有:萜类化合物和聚酮类化合物的代谢（119个基因）、其他次生代谢物的生物合成（122个基因）、生物降解和代谢（146个基因）、碳水化合物代谢（636个基因）以及氨基酸代谢（485个基因）等途径。链霉菌5-4基因组中还蕴含有51个次级代谢物生物合成基因簇,主要包括了NRPS、T1 PKS、T2 PKS、萜烯、细菌素、吲哚、四氢嘧啶、铁载体等合成基因簇,充分展示出链霉菌5-4具有很大的次级代谢产物潜能。6.通过链霉菌5-4在发酵过程中的代谢组学研究分析,发现其代谢产物差异显著,且大部分差异代谢物出现在培养的前期（2 d）和后期（7 d）。以VIP值>2且p<0.05为条件进一步筛选差异代谢物,共检测到990种代谢物,已知物质只有46种,表明链霉菌5-4发酵液的组分复杂,仍有大量的未知代谢物。链霉菌5-4在发酵第7d时产生的较大差异的已知代谢物主要有13种,且大多数具有抗菌活性。其中hygromycin B、sarmentosin、betavulgaroside VIII、pubescenol等代谢物可能是抑菌作用的关键性代谢物。对筛选得到的差异代谢物进行代谢通路分析,发现主要涉及了精氨酸和脯氨酸代谢,甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的代谢,组氨酸代谢,氨基丙酸代谢,甘油磷脂代谢,卟啉和叶绿素代谢,酰胺t RNA生物合成,抗生素生物合成,植物次生代谢产物的生物合成等通路。综上所述,链霉菌5-4是一株具有香蕉枯萎病拮抗性能、促生能力的生防菌株,可作为绿色防治香蕉枯萎病的生物菌剂。