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背景和目的：肺癌是我国发病率、死亡率增长最快，而且预后最差的肿瘤之一。转移是导致患者死亡的直接原因。循环系统中存活的肿瘤细胞是远处转移和复发的基础。由于转移的早期癌细胞数量少，病灶小，对化疗药物相对敏感，此时如能及时检测到血液循环系统中存活的肿瘤细胞并对具体患者实施针对性的全身性辅助治疗和化疗将可以提高疗效。若错过时机肿瘤就会生长成为较大的病灶，其内部将含较多的缺氧细胞，对化疗药物的敏感性降低，必然会影响疗效。目前临床上尚缺乏判断某一病人是否需要化疗的直接指标，如果能通过实验方法，把循环系统中存在转移癌细胞的病人从病人整体中区分出来，有的放矢地给予相对适宜的化疗，将能提高这部分病人的疗效，同时也可以避免另一部分病人不必要的化疗，提高其生活质量。因此早期诊断肺癌转移，尤其是肺癌微转移对临床制定治疗方案及患者的预后都有重要的意义。然而，这一类细胞数量极微，其特异性的蛋白质标志物少，不易被临床上常规技术检测到。目前肺癌微转移的特异性标志物还没找到。因此，寻找一种特异性的肿瘤标志物和建立一种高度灵敏的检测方法来检测病人循环系统中该肿瘤细胞标志物，对肺癌患者的诊断、分期和预后的判定具有重要的临床意义。CK19属细胞角蛋白家族(Cytokeratins，CKS)，CKS由分子量40KD到68KD的20个成员组成。主要在上皮细胞和上皮性肿瘤细胞中表达，在其它组织中不表达。CK19不郑州大学2004年硕士研究生毕业论文巢式RT~PCR技术在检测肺癌患者微量转移癌细胞中的临床应用研究在正常淋巴结、外周血、骨髓中表达。而在肺癌组织中广泛表达。因此监测CK19一mRNA水平，可判断肺癌的情况。故此我们采用巢式RT一PCR对肺癌组，肺部良性病变组及健康对照组外周血和淋巴结中CK19一二RNA的表达情况进行了检测，以企研究外周血和淋巴结中CK19一mRNA表达水平与肺癌临床病理特征的关系，探讨CK 19一InRNA是否可以作为肺癌微转移的特异性标志物以及巢式RT一PCR法在微转移检测中的可行性。 材料与方法 1、病例选择所有病例均为河南省胸科医院，河南省人民医院胸外科住院患者。所有患者于治疗前抽取新鲜肝素抗凝血5ml，术中将每例患者肺门和纵隔等处的各组区域淋巴结全部清除，然后在严格防止污染的前提下，将每枚淋巴结切分成两等份，一份作病理检查(HE染色)，另一份淋巴结液氮速冻，而后转入一80℃冰箱保存，直至提取RNA。 2、研究分组:(l)肺癌组选2001年一2002年10月间76例肺癌患者，其中男性54例，女性22例;平均年龄(56.8士7.8)岁;本组患者的肿瘤的分类、TNM分期均按国际UICC1997分期标准。其中按病理类型分为鳞癌38例、腺癌27例、小细胞癌n例;低分化组20例、中分化35例、高分化例21例;P一TNM分期Ia7例、Ibg例、11 a13例、11 b15例、Illa12例、Illb7例、W13例;有淋巴结转移23例。远处转移10例(锁骨上淋巴结转移5例、胸膜转移2例、脑转移1例、骨转移1例、肝转移1例)(2)肺部良性疾病组:27例，其中男性17例、女性10例;平均年龄(55.6士7.5)岁;肺炎及支气管炎12例、结核5例、支气管扩张3例、炎性假瘤3例、脓肿4例。③另收集15例健康人外周血标本作为对照:其中男性9例、女性6例;平均年龄(31.3士5.8)岁。诊断由影像学检查、组织学检查等确定; 方法:以cK19一mRNA作为肺癌的肿瘤标志物，采用巢式逆转录聚合酶链式反应(nest reverse transeripti。n polymerase ehain reaetion，RT一PCR)技术进行检测。统计学方法:采用F 1 sher精确概率计算法与厂检验，所有数据均经SPSSll.O统计软件进行统计学处理，显著性水准为0.肠。 结果郑州大学2004年硕士研究生毕业论文巢式RT一PCR技术在检测肺癌患者微量转移癌细胞中的临床应用研究 1.本实验用巢式RT一PCR法检测CK 1 gmRNA的灵敏度为10一6，特异性为98.1%。 2.外周血标本中CK19一mRNA的检测结果本实验中76例肺癌患者外周血标本中，39例CK19一mRNA阳性，阳性率为51.3%，27例肺部良性病变中，仅1例(肺结核)CK19一mRNA为阳性，15例健康对照组无1例阳性，肺癌患者CK 19一mRNA检出率较肺部良性病变组、健康对照组明显增加(P<0.05)。 3.外周血CK19一mRNA阳性率在低分化组高于高、中分化组(只0.05);有淋巴结转移组显著高于无淋巴结转移组(尸<0.01);远处转移组显著高于无远处转移组(只0.05);111期+W期组显著高于I期+11期组(代0.01);各组织学类型间比较差异有显著性(尸(0.001)。CK19一mRNA阳性率在不同性别、年龄、肿瘤大小间比较差异无显著性(尸>0 .05)。 4.肺癌组淋巴结中CK19mRNA表达率为38.9%(61/l 57)，肺良性病变组及健康对照组中均未检测到CK19mRNA表达，两组之间有显著性差异(尸均(0.05)。在I期、11期、111期、W期CK19一mRNA阳性率分别为30.8%(5/16)、38.4%(13/28)、84.2%(16/19)、100%(13/13)，各期之间有显著性差异(p均(0 .05)。 5.157枚淋巴结中巢式RT一PCR法检测出61枚存在微转移，常规病理方法检测出23枚淋巴结存在转移，阳性率分别为38.9%和14.6%;在HE染色阴性的134枚淋巴结中，经