【摘 要】
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绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoniae,Mo）是引起绵羊和山羊支原体肺炎的主要病原之一,感染后临床症状主要表现为咳嗽、喘气、渐进性消瘦以及肺间质增生性炎症等,是一种世界性的传染病。Mo菌株基因型具有多样性的特点,研究发现不同羊场的分离株之间RFLP图谱存在显著差异,且在同一个病羊的肺内可分离出多株基因结构不同的Mo,表明各菌株间基因结构有所不同。目前尚未见以全基因组水平的
【基金项目】
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2016国家重点研发计划项目子课题,课题名称:牛羊支原体肺炎快速诊断技术研究,课题编号:2016YFD0500907； 家畜疫病病原生物学国家重点实验室重大成果培育计划,课题名称:重要羊支原体病防控技术新产品创制与应用,课题编号:2019-07；
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绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoniae,Mo）是引起绵羊和山羊支原体肺炎的主要病原之一,感染后临床症状主要表现为咳嗽、喘气、渐进性消瘦以及肺间质增生性炎症等,是一种世界性的传染病。Mo菌株基因型具有多样性的特点,研究发现不同羊场的分离株之间RFLP图谱存在显著差异,且在同一个病羊的肺内可分离出多株基因结构不同的Mo,表明各菌株间基因结构有所不同。目前尚未见以全基因组水平的差异比对来分析不同菌株的蛋白编码区（CDS）序列和筛选种特异性的诊断新靶标。目的:（1）利用比较基因组方法筛选出Mo种间和种内特异的蛋白编码区（CDS）序列。（2）选择部分种特异性的蛋白编码基因作为潜在的分子诊断靶标,通过普通PCR验证靶标特异性、所建方法的敏感性和临床检测的适应性（2）选择种特异性的编码蛋白作为候选抗原靶标,分析其抗原性,构建表达载体、表达并纯化得到目的蛋白,通过WB实验初步评估抗原性和特异性。方法:（1）将14株已公布的Mo全基因组序列进行初次筛选,获得同源性较高的序列,再与精氨酸支原体（Mycoplasma arginine,Marg）、丝状支原体山羊亚种（Mycoplasma mycoides subsp.Capri,Mmc）、山羊支原体山羊肺炎亚种（Mycoplasma capricolum subsp.Capripneumoniae,Mccp）等羊呼吸道支原体基因组进行比对后获得种间特异性编码序列,最后与51株本地分离株基因组重测序数据进行比对获得Mo种内特异性蛋白编码基因。（2）将优选的Mo种内特异性蛋白编码基因,寻找与51株Mo共有的保守性片段。利用NCBI线上Primer BLAST程序设计引物,选择G/C含量较高的靶基因设计引物,通过引物筛选和反应条件优化,建立并利用核酸样品盘中53株Mo菌株、15株其它支原体和18株常见反刍动物细菌的DNA进行扩增,并检测27份临床样品DNA评估其特异性,与应用最广泛的LMF1/LMR1引物及其反应体系（PCR方法）比较,评价优选序列是否可作为Mo的核酸诊断靶标。（3）通过软件评估优选潜在的特异性编码蛋白,结合序列结构功能的预测结果,将符合要求的序列使用p ET-30a构建原核表达载体,并通过原核表达系统表达、IPTG诱导表达、Ni-IDA+亲和层析柱纯化获得重组蛋白,再通过WB评估重组蛋白的反应原性,初步评估重组蛋白是否可作为Mo新的血清学诊断靶标。结果:（1）NCBI 14个Mo基因组BLAST排除了与Marg、Mmc、Mccp同源性较高的序列,最终获得24个Mo种间特异性候选序列,将24个候选序列分别与51株本地Mo全基因组重测序结果进行BLAST,最终获得15个Mo种内特异性候选蛋白编码基因,13个Mo种内保守且特异的蛋白编码基因片段。（2）利用15个候选蛋白编码基因在51株Mo基因组中的共有保守性片段,选取4个序列的5个保守基因片段列设计11对引物。最终成功设计一对引物728 2F/2R,其对53株不同来源的Mo DNA,均能扩增出一条288 bp大小的目的条带,与预期条带大小相符,并无非特异性扩增。而反向核酸盘DNA为模板时,不能扩增出目的条带。并且728 2F/2R引物特异性优于LMF1/LMR1引物。（3）成功表达,纯化出重组蛋白258、728,WB验证发现258蛋白具有一定反应原性和特异性,728蛋白有一定反应原性但其特异性有待进一步评估。结论:（1）获得13个Mo种内保守且特异的候选蛋白编码基因片段。（2）728序列可作为Mo新分子诊断靶标,并成功设计一对新的Mo特异性引物728 2F/2R。（3）258重组蛋白具有一定反应原性及特异性,具有作为Mo新的血清学诊断靶标的潜力,但其使用条件还需优化。
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