论文部分内容阅读
研究背景：器官移植是治疗终末期器官疾病的重要方法之一,但供源缺乏和排斥反应是困扰器官移植的两大难题。肝细胞移植(hepatocyte transplantation, HT)最大的优点是可以一肝多用,使更多的人得到移植机会,降低等待肝源时的死亡率,因此有可能取代原位肝移植(orthotopic liver tranplantation, OLT)用于终末期肝脏疾病患者,但免疫排斥仍是HT需要解决的一个重要问题。随着现代基因工程的发展,具有免疫逃逸功能的转基因肝细胞成为HT的研究热点。腺病毒载体能够将外源基因安全而高效地转染入多种细胞,因此被广泛地应用于基因治疗的各个领域,但宿主对基因表达产物的排斥反应严重地限制了基因治疗的发展,临床现有的免疫抑制剂并不总是有效,而且毒副作用大。因此,降低或消除机体对外源基因表达产物及其转染细胞的免疫反应,成为长期基因治疗中的研究热点。主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)抗原呈递途径在免疫排斥方面的研究中越来越引起人们的关注,阻断MHCⅠ-抗原肽复合物的表达,成为诱导免疫耐受的研究热点。MHCⅠ限制性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes, CTL)在病毒感染中发挥着重要作用,干扰感染细胞表面MHCⅠ类分子抗原呈递途径来逃避宿主免疫清除的策略被许多病毒所利用。单纯疱疹病毒Ⅰ型(herpes simplex virus I, HSV-1)基因编码的立即早期感染性细胞蛋白47(infected cell protein 47,ICP47)能与抗原多肽竞争抗原加工相关转运子(transporter associated with antigen presentation,TAP)的肽结合位点,有效地降低CTL的识别和杀伤活性,逃逸宿主的免疫清除。因此,本研究构建了一种表达His-tag-ICP47融合基因的腺病毒载体,并研究其免疫活性,以期能够为研究机体免疫耐受机制和基因治疗提供重要的探索方向。此外,这些研究可能为拓展病毒免疫学领域,探索病毒和宿主免疫系统之间的相互作用提供了新的研究方向,并为临床疾病的治疗和预防拓展了更广阔的空间。第一部分表达His-tag-ICP47融合基因腺病毒载体的构建目的：构建表达His-tag-ICP47融合基因的重组腺病毒,并且进行扩增和滴度测定,以便用于其免疫活性的实验研究。方法：应用AdEasy-1月泉病毒表达载体系统构建表达His-tag-ICP47融合基因的重组腺病毒r-H-ICP47和对照空载重组腺病毒r-Track。His-tag-ICP47融合基因首先克隆到pAdTrack-CMV载体上,用PmeⅠ酶切后与腺病毒骨架载体pAdEasy-1在BJ5183菌内同源重组构建重组腺病毒载体pAdEasy-H-ICP47,PacⅠ酶切线性化后,重组腺病毒载体pAdEasy-H-ICP47在293细胞内包装为重组腺病毒r-H-ICP47。以同样的方法构建对照空载重组腺病毒r-Track。最终,扩增并检测病毒滴度。结果：重组腺病毒r-H-ICP47和r-Track构建成功并且具有良好的感染性,可以在293细胞中包装成病毒颗粒。重组腺病毒r-H-ICP47和r-Track的滴度测定结果分别为3.7×1010efu/mL和4.4x 1010efu/mL结论：复制缺陷型重组腺病毒r-H-ICP47和r-Track成功构建,病毒滴度高,能够在细胞内有效地转染和表达,能够满足下一步免疫活性研究的要求。第二部分表达His-tag-ICP47融合基因重组腺病毒的免疫活性研究目的：观察表达His-tag-ICP47融合基因重组腺病毒的免疫活性。方法：1.重组腺病毒r-H-ICP47或r-Track转染HL-7702肝细胞,测定对HL-7702细胞的转染效率,并用MTT法测定CTL对转染HL-7702细胞的杀伤活性。2.以健康人外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)为来源,体外诱导培养树突状细胞(dendritic cells, DCs),测定重组腺病毒r-H-ICP47或r-Track对转染DCs的转染效率,并且采用MTT法测定第24h、48h和72h时重组腺病毒r-H-ICP47或r-Track对转染DCs刺激淋巴细胞增殖活性的影响。3.重组腺病毒r-H-ICP47或r-Track转染淋巴细胞,测定转染效率,并进行双向混合淋巴细胞反应(Two-way mixed lymphocyte reaction, Two-way MLR),采用ELISA法分别于第2d、第4d和第6d测定各组MLR上清液中白细胞介素-2 (Interleukin-2, IL-2)和穿孔素(perforin, PF)的浓度。结果：1.重组腺病毒r-H-ICP47和r-Track均能高效转染HL-7702肝细胞株,感染效率随着感染复数(multiplicity of infection, MOI)升高而升高。当MOI为100时,重组腺病毒r-H-ICP47和r-Track对HL-7702细胞的转染效率(86.87±3.14%和90.32±2.25%)均明显高于MOI为50的转染效率(29.52±5.22%和32.12±2.27%)(P<0.05),而与MOI为200的转染效率(88.53±3.69%和90.64±3.65%)无显著性差异(P>0.05)。当MOI为100的重组腺病毒r-H-ICP47或r-Track转染HL-7702肝细胞后,进行CTL杀伤活性实验,结果显示,与r-track组和正常对照组相比,r-H-ICP47组能明显降低CTL对转染HL-7702细胞的杀伤活性(P<0.05)。2.重组腺病毒r-H-ICP47和r-Track对DCs的感染效率随着MOI升高而升高,当MOI为100时,重组腺病毒r-H-ICP47和r-Track对DCs的转染效率(86.92±2.76%和84.08±2.62%)均明显高于MOI为50的转染效率(30.32±3.08%和23.70±3.23%)(P<0.05),而与MOI为200的转染效率(91.26±2.59%和87.51士2.41%)无显著性差异(P>0.05)。MTT检测结果显示,与重组腺病毒r-Track组和正常对照组相比,在培养的第48h和第72h,重组腺病毒r-H-ICP47能够较明显地降低转染DCs刺激淋巴细胞增殖的能力(P<0.05),而在第24h时,DCs刺激淋巴细胞的增殖活性在3组之间均无明显差异(P>0.05)。3.重组腺病毒r-H-ICP47和r-Track对淋巴细胞的感染效率随着MOI升高而升高,当MOI为100时,重组腺病毒r-H-ICP47和r-Track对淋巴细胞的转染效率(87.11±3.29%和82.21±4.01%)均明显高于MOI为50的转染效率(25.54±4.07%和27.67±2.31%)(P<0.05),而与MOI为200的转染效率(89.75±2.92%和85.99±3.02%)无显著性差异(P>0.05)。Two-way MLR分为5组,D-R-ICP47、D-ICP47组、D-R-Track组、D-Track组和正常对照组,分别用MOI为100的重组腺病毒r-H-ICP47或r-Track转染供体(D)或受体(R)的淋巴细胞后进行Two-way MLR培养,采用ELISA法分别在第2d、第4d和第6d检测MLR上清液中IL-2和PF的浓度。结果显示在各个时间段D-R-ICP47组IL-2和PF的浓度均明显低于其余4组(P<0.05),并且D-ICP47组IL-2和PF的浓度也低于D-R-Track组、D-Track组和正常对照组(P<0.05)。结论：1.表达His-tag-ICP47的重组腺病毒能够安全、高效地转染HL-7702细胞、DCs和淋巴细胞,并达到理想的表达水平。2.表达His-tag-ICP47融合基因的重组腺病毒能够有效地降低CTL对转染HL-7702肝细胞的特异性杀伤活性,降低转染DCs刺激淋巴细胞增殖的能力和Two-way MLR上清液中IL-2和PF的表达程度。这些结果在一定程度上可预测His-tag-ICP47融合基因能够降低机体对转染细胞和腺病毒载体排斥反应发生的程度,提示表达His-tag-ICP47融合基因的腺病毒载体及其转染细胞能够介导免疫耐受,达到外源基因长期表达的目的。