论文部分内容阅读
研究目的:制备透明质酸-金纳米粒子(HA-Au NPs)复合物,在体外初步探究HA-Au NPs复合物对大鼠骨关节炎软骨细胞IL-1、TNF-α、MMP-13的mRNA表达及凋亡的影响。研究方法:1、分别采用三种不同的方法制备出不同形状的Au NPs,观察三种Au NPs的溶液颜色,通过紫外可见分光光度计检测Au NPs特征吸收峰,透射电子显微镜观察Au NPs形貌,CCK-8检测Au NPs的细胞毒性;2、制备HA-Au NPs复合物,观察HA-Au NPs的溶液颜色,通过紫外可见分光光度计检测HA-Au NPs特征吸收峰,透射电子显微镜观察HA-Au NPs形貌;3、选用4只8周龄SD大鼠随机分成2组,其中2只SD大鼠采用左膝关节前交叉韧带+内侧副韧带切断术造模(OA造模组),另外2只SD大鼠只切开左膝关节,不做任何韧带切断(Sham对照组);8周后分别获取2组左膝关节骨关节炎原代软骨细胞;4、采用Ⅱ型胶原蛋白免疫细胞化学染色、甲苯胺蓝染色和阿利新蓝染色对原代软骨细胞进行鉴定;5、将培养的第二代软骨细胞分成5个组:分别为A组(Sham对照组)、B组(OA对照组)、C组(OA+HA组)、D组(OA+Au NPs组)和E组(OA+HA-Au NPs组)。运用qRT-PCR方法检测5组软骨细胞IL-1、TNF-α、MMP-13的mRNA表达水平。6、采用流式细胞术检测各组软骨细胞凋亡情况。结果:1、制备出的三种Au NPs溶液颜色、紫外可见吸收光峰、形貌、细胞毒性各不同。球状Au NPs溶液呈酒红色可见吸收光谱在525nm有一个吸收峰,其形貌呈圆球状,周围光滑,大小均一;棒状Au NPs溶液呈现棕黄色,紫外可见吸收光谱有两个吸收峰,分别在500nm、820nm处,其形貌呈短棒状,均匀分布;雪花状Au NPs溶液呈灰黑色,可见光吸收图谱在560nm处有一个吸收峰,其形貌呈雪花状,形状不规则。球状Au NPs细胞毒性相对较小,雪花状Au NPs细胞毒性次之,棒状Au NPs细胞毒性最强。2、制备的HA-Au NPs溶液呈酒红色,HA-Au NPs可见吸收光峰在528nm附近,其形貌呈圆球状,周围包覆一层透明薄层,HA-Au NPs构建成功。3、2组造模大鼠膝关节液、关节面情况不一,前交叉韧带与内侧副韧带切断造模组大鼠关节液稠、黄褐色,关节面粗糙、部分磨损,关节外缘可见少量骨赘形成;假手术组大鼠关节液较稀、淡黄色,关节面较光滑,关节未见明显磨损及骨赘形成。4、软骨细胞经甲苯胺蓝染色后细胞核呈现为深蓝色,经阿利新蓝染色后细胞质呈现为淡蓝色,经Ⅱ型胶原蛋白免疫组化染色后细胞质呈现为黄褐色。5、qRT-PCR检测结果表明,A组(Sham对照组)、C组(OA+HA组)、D组(OA+Au NPs组)和E组(OA+HA-Au NPs组)中IL-1、TNF-α、MMP-13的mRNA表达量明显低于B组(OA对照组),差异具有统计学意义(p<0.05);E组(OA+HA-Au NPs组)中IL-1、TNF-α、MMP-13的mRNA表达量低于C组(OA+HA组)和D组(OA+Au NPs组),差异具有统计学意义(p<0.05);D组(OA+Au NPs组)中的IL-1、TNF-α、MMP-13的mRNA表达量低于C组(OA+HA组),差异具有统计学意义(p<0.05)。6、细胞凋亡检测结果表明,A组(Sham对照组)、C组(OA+HA组)、D组(OA+Au NPs组)和E组(OA+HA-Au NPs组)中软骨细胞凋亡率低于B组(OA对照组),差异具有统计学意义(p<0.05);E组(OA+HA-Au NPs组)软骨细胞凋亡率低于C组(OA+HA组)和D组(OA+Au NPs组),差异具有统计学意义(p<0.05);D组(OA+Au NPs组)软骨细胞凋亡率低于C组(OA+HA组),差异具有统计学意义(p<0.05)。结论:1、成功制备的球状Au NPs、HA-Au NPs稳定性好,生物相容性好,细胞毒性小;2、HA-Au NPs、Au NPs与HA均可以抑制骨关节炎软骨细胞IL-1、TNF-α、MMP-13的mRNA表达,且HA-Au NPs的抑制能力最强;3、HA-Au NPs、Au NPs与HA均可以抑制骨关节炎软骨细胞凋亡,且HAAu NPs抑制能力最强。